Induction et la Validation de la sénescence cellulaire dans les cellules humaines primaires
Summary
Ici, nous discutons une série de protocoles pour l’induction et la validation de la sénescence cellulaire dans les cellules cultivées. Nous nous concentrons sur différents stimulus induisant la sénescence et décrire la quantification de marqueurs communs liés à la sénescence. Nous fournissons des détails techniques à l’aide de fibroblastes comme modèle, mais les protocoles peuvent être adaptés aux différents modèles cellulaires.
Abstract
Sénescence cellulaire est un état d’arrêt permanent cycle cellulaire activé en réponse à différents stimuli nocifs. Activation de la sénescence cellulaire est une caractéristique de diverses conditions physiopathologiques, y compris la suppression tumorale, remodelage et le vieillissement des tissus. Les inducteurs de la sénescence cellulaire in vivo sont encore mal caractérisés. Toutefois, un certain nombre de stimuli peut servir à promouvoir la sénescence cellulaire ex vivo. Parmi eux, les plus courantes de sénescence-inducteurs sont réplicative épuisement, ionisant et non ionisant, génotoxique drogues, stress oxydatif et demethylation et agents d’acétylation. Ici, nous fournirons des instructions détaillées sur l’utilisation de ces stimuli pour induire des fibroblastes en sénescence. Ce protocole peut être facilement adapté pour différents types de piles et de lignées cellulaires, y compris les cellules cancéreuses. Nous décrivons également différentes méthodes pour la validation de l’induction de la sénescence. En particulier, nous nous concentrons sur la mesure de l’activité de l’enzyme lysosomale associés à la sénescence β-galactosidase (SA-β-gal), le taux de synthèse de l’ADN à l’aide d’analyse 5-éthynyl-2′-déoxyuridine (EdU), les niveaux d’expression du cycle cellulaire inhibiteurs p16 et p21 et l’expression et la sécrétion des membres de la phénotype sécrétoire Senescence-Associated (SASP). Enfin, nous fournir les résultats de l’exemple et en discuter plus les applications de ces protocoles.
Introduction
En 1961, Hayflick et Moorhead a signalé que les fibroblastes en culture primaires perdent leur potentiel prolifératif après passages successifs1. Ce processus est provoqué par le séquentiel raccourcissement des télomères après chaque division cellulaire. Quand les télomères atteignent une critique courte longueur, ils sont reconnus par la réponse de lésions de l’ADN (DDR) qui active un arrêt irréversible de prolifération — aussi défini comme la sénescence réplicative. La sénescence réplicative est actuellement l’un des nombreux stimuli qui sont connus pour induire un état de l’arrestation de cycle de cellules permanentes qui rend les cellules insensibles aux mitogènes tant des signaux apoptotic2,3. Le programme de sénescence est normalement caractérisé par des fonctionnalités supplémentaires, y compris la forte activité lysosomale, dysfonctionnement mitochondrial, modifications nucléaires, réarrangements de la chromatine, stress du réticulum endoplasmique, dommages à l’ADN et associée à une sénescence phénotype sécrétoire (SASP)3,4. Les cellules sénescentes ont de multiples fonctions dans le corps : développement, wound healing et tumeur suppression2. De même, ils sont connus pour jouer un rôle important dans le vieillissement et, paradoxalement, en progression de tumeur5. Les effets négatifs et partiellement contradictoires, de sénescence sont souvent attribués à la SASP6.
Récemment, il a été démontré qu’élimination des cellules sénescentes de souris conduit à la prolongation de la durée de vie et à l’élimination d’un grand nombre du vieillissement caractéristiques7,8,9,10,11, 12. de la même façon, plusieurs médicaments ont été développés pour soit éliminer les cellules sénescentes (senolytics) ou de cibler les SASP13,14. Le potentiel thérapeutique de l’anti-aging a récemment attiré plus d’attention au champ.
L’étude des mécanismes liés à la sénescence cellulaire et les projections pour les interventions pharmacologiques insistent beaucoup sur les modèles ex vivo , particulièrement sur les fibroblastes humains primaires. Bien qu’il existe certaines caractéristiques communes activés par des inducteurs de sénescence divers, une grande variabilité dans le phénotype de la sénescence est observée et dépend de divers facteurs, notamment la cellule type, stimulation et temps point3,15, 16,17. Il est impératif de tenir compte de l’hétérogénéité pour l’étude et le ciblage des cellules sénescentes. Par conséquent, ce protocole vise à fournir une série de méthodes utilisées pour induire la sénescence dans des fibroblastes de primaires à l’aide de différents traitements. Comme il sera expliqué, les méthodes peuvent facilement être adaptés à d’autres types de cellules.
En dehors de la sénescence réplicative, les auteurs décrivent cinq autres traitements induisant la sénescence : rayonnement ionisant rayonnement, rayonnement ultraviolet (UV), doxorubicine, le stress oxydatif et les changements épigénétiques (à savoir la promotion de l’acétylation des histones ou de déméthylation de l’ADN) . Rayonnements ionisants et rayonnement UV endommager directe de l’ADN et, à la dose appropriée, déclenchent la sénescence18,19. Doxorubicine provoque également la sénescence principalement par le biais de dommages à l’ADN par intercalation dans l’ADN et perturbent la fonction de topoisomérase II et ainsi mettre un terme à l’ADN réparation mécanismes20. L’expression des gènes essentiels à la sénescence est normalement contrôlée par l’acétylation des histones et la méthylation de l’ADN. En conséquence, les inhibiteurs d’histone déacétylase (p. ex., le butyrate de sodium et SAHA) et ADN demethylating (p. ex., 5-aza) agents déclenchent sénescence dans les cellules normales sinon21,22.
Enfin, quatre des marqueurs plus communs associés aux cellules sénescentes sera expliqué : l’activité de la sénescence associés-β-galactosidase (SA-β-gal), taux de synthèse de l’ADN par EdU analyse, la surexpression des régulateurs de cycle cellulaire et p16 inhibiteurs de kinase cycline-dépendante et p21 et surexpression et la sécrétion des membres de la SASP.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les protocoles expliqués ici ont été optimisées pour des fibroblastes humains primaires, en particulier les cellules BJ et WI-38. Les protocoles pour la sénescence réplicative, rayonnements ionisants et la doxorubicine, ont été appliquées avec succès à d’autres types de fibroblastes (HCA2 et IMR90) et dans d’autres types de cellules (à savoir néonatales mélanocytes et kératinocytes ou cardiomyocytes dérivés iPSC) dans notre laboratoire. Toutefois, des adaptations pour les types de cellules supplémen…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions les membres du laboratoire Demaria pour des discussions fructueuses et Thijmen van Vliet pour le partage de données et protocole sur la sénescence induite par l’UV.
Materials
| DMEM Media – GlutaMAX | Gibco | 31966-047 | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SV30160.03 | |
| Penicillin-Streptomycin (P/S; 10,000 U/ml) | Lonza | DE17-602E | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | SC-202581 | |
| Nuclease-Free Water (not DEPC-Treated) | Ambion | AM9937 | |
| T75 flask | Sarstedt | 833911002 | |
| Trypsin/EDTA Solution | Lonza | CC-5012 | |
| PBS tablets | Gibco | 18912-014 | |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | Sigma-Aldrich | T9661-1000EA | |
| Corning 15 mL centrifuge tubes | Sigma-Aldrich | CLS430791 | |
| 6-well plate | Sarstedt | 83.3920 | |
| 24-well plate | Sarstedt | 83.3922 | |
| 13mm round coverslips | Sarstedt | 83.1840.002 | |
| Steriflip | Merck Chemicals | SCGP00525 | |
| Cesium137-source | IBL 637 Cesium-137γ-ray machine | ||
| UV radiation chamber | Opsytec, Dr. Göbel BS-02 | ||
| Doxorubicin dihydrochloride | BioAustralis Fine Chemicals | BIA-D1202-1 | |
| Hydrogen peroxide solution | Sigma-Aldrich | 7722-84-1 | |
| 5-aza-2’-deoxycytidine | Sigma-Aldrich | A3656 | |
| SAHA | Sigma-Aldrich | SML0061 | |
| Sodium Butyrate | Sigma-Aldrich | B5887 | |
| X-gal (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside) | Fisher Scientific | 7240-90-6 | |
| Citric acid monohydrate | Sigma-Aldrich | 5949-29-1 | |
| Sodium dibasic phosphate | Acros organics | 7782-85-6 | |
| Potassium ferrocyanide | Fisher Scientific | 14459-95-1 | |
| Potassium ferricyanide | Fisher Scientific | 13746-66-2 | |
| Sodium Chloride | Merck Millipore | 7647-14-5 | |
| Magnesium Chloride | Fisher Chemicals | 7791-18-6 | |
| 25% glutaraldehyde | Fisher Scientific | 111-30-8,7732-18-5 | |
| 16% formaldehyde (w/v) | Thermo-Fisher Scientific | 28908 | |
| EdU (5-ethynyl-2’-deoxyuridine) | Lumiprobe | 10540 | |
| Sulfo-Cyanine3 azide (Sulfo-Cy3-Azide) | Lumiprobe | D1330 | |
| Sodium ascorbate | Sigma-Aldrich | A4034 | |
| Copper(II) sulfate pentahydrate (Cu(II)SO4.5H2O) | Sigma-Aldrich | 209198 | |
| Triton X-100 | Acros organics | 215682500 | |
| TRIS base | Roche | 11814273001 | |
| LightCycler 480 Multiwell Plate 384, white | Roche | 4729749001 | |
| Lightcycler 480 sealing foil | Roche | 4729757001 | |
| Sensifast Probe Lo-ROX kit | Bioline | BIO-84020 | |
| UPL Probe Library | Sigma-Aldrich | Various | |
| Human IL-6 DuoSet ELISA | R&D | D6050 | |
| Bio-Rad TC20 | Bio-Rad | ||
| Counting slides | Bio-Rad | 145-0017 | |
| Dry incubator | Thermo-Fisher Scientific | Heratherm | |
| Dimethylformamide | Merck Millipore | 1.10983 | |
| Parafilm 'M' laboratory film | Bemis | #PM992 | |
| Tweezers | |||
| Needles |
References
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