Indução e validação da senescência celular em células humanas primárias
Summary
Aqui, vamos discutir uma série de protocolos para indução e validação da senescência celular em culturas de células. Podemos focar diferentes estímulos indutores senescência e descrever a quantificação de marcadores comuns associadas a senescência. Nós fornecemos detalhes técnicos utilizando fibroblastos como modelo, mas os protocolos podem ser adaptados para vários modelos de celulares.
Abstract
Senescência celular é um estado de prisão permanente ciclo celular ativado em resposta a diferentes estímulos nocivos. Ativação da senescência celular é uma marca registrada de diversas condições fisiopatológicas incluindo supressão de tumor, tecido, remodelação e envelhecimento. Os indutores da senescência celular na vivo caracterizam-se ainda mal. No entanto, uma série de estímulos pode ser usada para promover a senescência celular ex vivo. Entre eles, indutores de senescência mais comuns são exaustão replicative, ionizante e radiação não-ionizante, drogas genotóxicas, estresse oxidativo e demethylating e acetificar agentes. Aqui, iremos fornecer instruções detalhadas sobre como usar esses estímulos para induzir os fibroblastos em senescência. Este protocolo pode ser facilmente adaptado para diferentes tipos de células primárias e de linhagens celulares, incluindo as células cancerosas. Também descrevemos os métodos diferentes para a validação da indução da senescência. Em particular, focamos em medir a atividade da enzima lisossomal associada a senescência β-galactosidase (SA-β-gal), a taxa de síntese de DNA utilizando o ensaio de incorporação 5-ethynyl-2′-desoxiuridina (EdU), os níveis de expressão do ciclo celular p16 inibidores e p21 e a expressão e secreção de membros do fenótipo secretor Senescence-Associated (SASP). Finalmente, podemos fornecer resultados de exemplo e discutir aplicações desses protocolos.
Introduction
Em 1961, Hayflick e Moorhead relataram que fibroblastos primários na cultura perdem seu potencial proliferativo após sucessivas passagens1. Este processo é causado pelo sequencial encurtamento dos telômeros após cada divisão celular. Quando os telômeros atingir um comprimento curto criticamente, eles são reconhecidos pela resposta DNA-danos (DDR) que ativa uma detenção irreversível da proliferação — também definida como senescência replicative. Senescência replicative é atualmente um dos muitos estímulos que são conhecidos por induzir a um estado de prisão permanente ciclo celular que reproduz células minúsculas de mitógenos e apoptotic sinais2,3. O programa de senescência normalmente é caracterizado por recursos adicionais, incluindo a alta atividade dos lisossomos, disfunção mitocondrial, alterações nucleares, rearranjos de cromatina, stress do retículo endoplasmático, danos ao DNA e uma senescência-associados o fenótipo secretor (SASP)3,4. As células senescentes têm múltiplas funções no corpo: desenvolvimento, ferida cura e tumor supressão2. Igualmente, eles são conhecidos por desempenhar um papel importante no envelhecimento e, paradoxalmente, em progressão de tumor5. Os efeitos negativos e parcialmente contraditórios, a senescência são frequentemente atribuídos a SASP6.
Recentemente, foi demonstrado que a eliminação de células senescentes de ratos leva a extensão de vida útil e a eliminação de muitos do envelhecimento características7,8,9,10,11, 12. da mesma forma, várias drogas têm sido desenvolvidas para também eliminar as células senescentes (senolytics) ou para direcionar o SASP13,14. O potencial terapêutico antienvelhecimento recentemente tem atraído mais atenção ao campo.
O estudo dos mecanismos associados à senescência celular e as projecções para intervenções farmacológicas dependem fortemente ex vivo modelos, particularmente em fibroblastos humanos primários. Embora existam algumas características comuns ativadas por indutores de diversas senescência, uma grande variabilidade do fenótipo de senescência é observado e dependente de vários factores, incluindo a célula tipo, o estímulo e o tempo ponto3,15, 16,17. É imperativo considerar a heterogeneidade para estudar e orientar células senescentes. Portanto, esse protocolo visa fornecer uma série de métodos utilizados para induzir a senescência em fibroblastos primários usando tratamentos diferentes. Como será explicado, os métodos podem ser facilmente adaptados para outros tipos de células.
Além de senescência replicative, descrevemos cinco outros tratamentos senescência de indução: ionizando radiação, radiação ultravioleta (UV), doxorrubicina, estresse oxidativo e alterações epigenéticas (nomeadamente promoção da acetilação da histona ou demetilação do ADN) . Ambos, radiação ionizante e radiação UV causam danos diretos do DNA e, com a dose apropriada, desencadear senescência18,19. Doxorrubicina também provoca senescência principalmente através de dano do ADN por intercalação no DNA e interromper a função de topoisomerase II e assim travar o DNA reparo mecanismos20. A expressão de genes essenciais para a senescência é normalmente controlada por acetilação da histona e metilação do DNA. Como consequência, inibidores de deacetilase de histona (por exemplo, o butirato de sódio e Santos) e DNA demethylating (por exemplo, 5-aza) agentes desencadear senescência em células normais21,22.
Finalmente, quatro dos marcadores mais comuns associados às células senescentes será explicado: atividade da senescência associado-β-galactosidase (SA-β-gal), taxa de síntese de DNA por ensaio de incorporação de EdU, superexpressão dos reguladores do ciclo celular e p21, p16 de inibidores da quinase cyclin-dependente e superexpressão e secreção de membros da SASP.
Protocol
Representative Results
Discussion
Os protocolos explicados aqui foram otimizados para fibroblastos humanos primários, particularmente células BJ e WI-38. Os protocolos para a senescência replicative, radiação ionizante e doxorrubicina, foram aplicados com sucesso para outros tipos de fibroblastos (HCA2 e IMR90) e em outros tipos de células (nomeadamente neonatais melanócitos e queratinócitos ou cardiomyocytes iPSC-derivado) em nosso laboratório. No entanto, adaptações para tipos de células adicionais podem ser otimizadas ajustando alguns deta…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a membros do laboratório Demaria para discussões frutuosos e Thijmen van Vliet para compartilhar dados e protocolo sobre a senescência induzida por UV.
Materials
| DMEM Media – GlutaMAX | Gibco | 31966-047 | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SV30160.03 | |
| Penicillin-Streptomycin (P/S; 10,000 U/ml) | Lonza | DE17-602E | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | SC-202581 | |
| Nuclease-Free Water (not DEPC-Treated) | Ambion | AM9937 | |
| T75 flask | Sarstedt | 833911002 | |
| Trypsin/EDTA Solution | Lonza | CC-5012 | |
| PBS tablets | Gibco | 18912-014 | |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | Sigma-Aldrich | T9661-1000EA | |
| Corning 15 mL centrifuge tubes | Sigma-Aldrich | CLS430791 | |
| 6-well plate | Sarstedt | 83.3920 | |
| 24-well plate | Sarstedt | 83.3922 | |
| 13mm round coverslips | Sarstedt | 83.1840.002 | |
| Steriflip | Merck Chemicals | SCGP00525 | |
| Cesium137-source | IBL 637 Cesium-137γ-ray machine | ||
| UV radiation chamber | Opsytec, Dr. Göbel BS-02 | ||
| Doxorubicin dihydrochloride | BioAustralis Fine Chemicals | BIA-D1202-1 | |
| Hydrogen peroxide solution | Sigma-Aldrich | 7722-84-1 | |
| 5-aza-2’-deoxycytidine | Sigma-Aldrich | A3656 | |
| SAHA | Sigma-Aldrich | SML0061 | |
| Sodium Butyrate | Sigma-Aldrich | B5887 | |
| X-gal (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside) | Fisher Scientific | 7240-90-6 | |
| Citric acid monohydrate | Sigma-Aldrich | 5949-29-1 | |
| Sodium dibasic phosphate | Acros organics | 7782-85-6 | |
| Potassium ferrocyanide | Fisher Scientific | 14459-95-1 | |
| Potassium ferricyanide | Fisher Scientific | 13746-66-2 | |
| Sodium Chloride | Merck Millipore | 7647-14-5 | |
| Magnesium Chloride | Fisher Chemicals | 7791-18-6 | |
| 25% glutaraldehyde | Fisher Scientific | 111-30-8,7732-18-5 | |
| 16% formaldehyde (w/v) | Thermo-Fisher Scientific | 28908 | |
| EdU (5-ethynyl-2’-deoxyuridine) | Lumiprobe | 10540 | |
| Sulfo-Cyanine3 azide (Sulfo-Cy3-Azide) | Lumiprobe | D1330 | |
| Sodium ascorbate | Sigma-Aldrich | A4034 | |
| Copper(II) sulfate pentahydrate (Cu(II)SO4.5H2O) | Sigma-Aldrich | 209198 | |
| Triton X-100 | Acros organics | 215682500 | |
| TRIS base | Roche | 11814273001 | |
| LightCycler 480 Multiwell Plate 384, white | Roche | 4729749001 | |
| Lightcycler 480 sealing foil | Roche | 4729757001 | |
| Sensifast Probe Lo-ROX kit | Bioline | BIO-84020 | |
| UPL Probe Library | Sigma-Aldrich | Various | |
| Human IL-6 DuoSet ELISA | R&D | D6050 | |
| Bio-Rad TC20 | Bio-Rad | ||
| Counting slides | Bio-Rad | 145-0017 | |
| Dry incubator | Thermo-Fisher Scientific | Heratherm | |
| Dimethylformamide | Merck Millipore | 1.10983 | |
| Parafilm 'M' laboratory film | Bemis | #PM992 | |
| Tweezers | |||
| Needles |
References
- Hayflick, L., Moorhead, P. S. The serial cultivation of human diploid cell strains. Experimental Cell Research. 25, 585-621 (1961).
- Muñoz-Espín, D., Serrano, M. Cellular senescence: from physiology to pathology. Nature reviews. Molecular cell biology. 15, 482-496 (2014).
- Sharpless, N. E., Sherr, C. J. Forging a signature of in vivo senescence. Nature Reviews Cancer. 15 (7), 397-408 (2015).
- Correia-Melo, C., et al. Mitochondria are required for pro-ageing features of the senescent phenotype. The EMBO Journal. 10, e201592862 (2016).
- Loaiza, N., Demaria, M. Cellular senescence and tumor promotion: Is aging the key?. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Reviews on Cancer. , (2016).
- Coppe, J. P., et al. Senescence-associated secretory phenotypes reveal cell-nonautonomous functions of oncogenic RAS and the p53 tumor suppressor. PLoS Biology. 6 (12), 2853-2868 (2008).
- Baker, D. J., et al. Naturally occurring p16(Ink4a)-positive cells shorten healthy lifespan. Nature. 530 (7589), 184-189 (2016).
- Xu, M., et al. Targeting senescent cells enhances adipogenesis and metabolic function in old age. Elife. 4, e12997 (2015).
- Baker, D. J., et al. Clearance of p16Ink4a-positive senescent cells delays ageing-associated disorders. Nature. 479 (7372), 232-236 (2011).
- Jeon, O. H., et al. Local clearance of senescent cells attenuates the development of post-traumatic osteoarthritis and creates a pro-regenerative environment. Nature Medicine. 23 (6), 775-781 (2017).
- Demaria, M., et al. Cellular Senescence Promotes Adverse Effects of Chemotherapy and Cancer Relapse. Cancer Discovery. 7 (2), 165-176 (2017).
- Chang, J., et al. Clearance of senescent cells by ABT263 rejuvenates aged hematopoietic stem cells in mice. Nature Medicine. 22 (1), 78-83 (2016).
- Soto-Gamez, A., Demaria, M. Therapeutic interventions for aging: the case of cellular senescence. Drug Discov Today. 22 (5), 786-795 (2017).
- Childs, B. G., et al. Senescent cells: an emerging target for diseases of ageing. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (10), 718-735 (2017).
- Marthandan, S., et al. Conserved genes and pathways in primary human fibroblast strains undergoing replicative and radiation induced senescence. Biological Research. 49, 34 (2016).
- Marthandan, S., et al. Conserved Senescence Associated Genes and Pathways in Primary Human Fibroblasts Detected by RNA-Seq. PLoS One. 11 (5), e0154531 (2016).
- Hernandez-Segura, A., et al. Unmasking Transcriptional Heterogeneity in Senescent Cells. Current Biology. 27 (17), 2652-2660 (2017).
- Le, O. N., et al. Ionizing radiation-induced long-term expression of senescence markers in mice is independent of p53 and immune status. Aging Cell. 9 (3), 398-409 (2010).
- Hall, J. R., et al. C/EBPalpha regulates CRL4(Cdt2)-mediated degradation of p21 in response to UVB-induced DNA damage to control the G1/S checkpoint. Cell Cycle. 13 (22), 3602-3610 (2014).
- Nitiss, J. L. Targeting DNA topoisomerase II in cancer chemotherapy. Nature Reviews Cancer. 9 (5), 338-350 (2009).
- Pazolli, E., et al. Chromatin remodeling underlies the senescence- associated secretory phenotype of tumor stromal fibroblasts that supports cancer progression. Cancer Research. 72, 2251-2261 (2012).
- Venturelli, S., et al. Differential induction of apoptosis and senescence by the DNA methyltransferase inhibitors 5-azacytidine and 5-aza-2′-deoxycytidine in solid tumor cells. Molecular Cancer Therapeutics. 12, 2226-2236 (2013).
- Tennant, J. R. Evaluation of the Trypan Blue Technique for Determination of Cell Viability. Transplantation. 2, 685-694 (1964).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Lee, B. Y., et al. Senescence-associated β-galactosidase is lysosomal β-galactosidase. Aging Cell. 5, 187-195 (2006).
- Kopp, H. G., Hooper, A. T., Shmelkov, S. V., Rafii, S. Beta-galactosidase staining on bone marrow. The osteoclast pitfall. Histology and Histopathology. 22 (9), 971-976 (2007).
- Dimri, G. P., et al. A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (20), 9363-9367 (1995).
- Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (7), 2415-2420 (2008).
- Sherr, C. J., McCormick, F. The RB and p53 pathways in cancer. Cancer Cell. 2 (2), 103-112 (2002).
- Bunz, F., et al. Requirement for p53 and p21 to sustain G2 arrest after DNA damage. Science. 282 (5393), 1497-1501 (1998).
- Severino, J., Allen, R. G., Balin, S., Balin, A., Cristofalo, V. J. Is beta-galactosidase staining a marker of senescence in vitro and in vivo. Experimental Cell Research. 257 (1), 162-171 (2000).
- Stolzing, A., Coleman, N., Scutt, A. Glucose-induced replicative senescence in mesenchymal stem cells. Rejuvenation Research. 9 (1), 31-35 (2006).
- Blazer, S., et al. High glucose-induced replicative senescence: point of no return and effect of telomerase. Biochemical and Biophysical Research Communications. 296 (1), 93-101 (2002).
- Wiley, C. D., Campisi, J. From Ancient Pathways to Aging Cells-Connecting Metabolism and Cellular Senescence. Cell Metabolism. 23 (6), 1013-1021 (2016).
- Kumar, R., Gont, A., Perkins, T. J., Hanson, J. E. L., Lorimer, I. A. J. Induction of senescence in primary glioblastoma cells by serum and TGFbeta. Scientific Reports. 7 (1), 2156 (2017).
- Hypoxia Blagosklonny, M. V. MTOR and autophagy: converging on senescence or quiescence. Autophagy. 9 (2), 260-262 (2013).
- Meuter, A., et al. Markers of cellular senescence are elevated in murine blastocysts cultured in vitro: molecular consequences of culture in atmospheric oxygen. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 31 (10), 1259-1267 (2014).
- Coppe, J. P., et al. A human-like senescence-associated secretory phenotype is conserved in mouse cells dependent on physiological oxygen. PLoS One. 5 (2), e9188 (2010).
- van Deursen, J. M. The role of senescent cells in ageing. Nature. 509 (7501), 439-446 (2014).
- Kim, Y. M., et al. Implications of time-series gene expression profiles of replicative senescence. Aging Cell. 12, 622-634 (2013).
