Summary

Индукция и проверки клеточного старения в первичных клеток человека

Published: June 20, 2018
doi:

Summary

Здесь мы обсуждаем ряд протоколов для индукции и проверки клеточного старения в культивируемых клеток. Мы ориентируемся на различных раздражителей, вызывающие старение и описать количественного определения общего старения ассоциированных маркеров. Мы предоставляем технические детали, используя фибробластов в качестве модели, но протоколы могут быть адаптированы к различным сотовой модели.

Abstract

Клеточного старения является состояние постоянного клеточного цикла арест активирована в ответ на различные стимулы, повреждения. Активация клеточного старения является отличительной чертой различных патофизиологические условий, включая опухоли подавления, тканей ремоделирования и старения. По-прежнему плохо характеризуются индукторов сотовой старение в естественных условиях . Однако ряд стимулов может использоваться для содействия клеточного старения ex vivo. Среди них наиболее распространенные старение индукторов, репликативной истощения, ионизирующего и неионизирующего излучения, Генотоксичные препараты, оксидативный стресс и demethylating и ацетилировать агентов. Здесь мы предоставим детальные инструкции о том, как использовать эти стимулы, чтобы побудить фибробластов в старение. Этот протокол может быть легко адаптирована для различных типов начальных клеток и клеточных линий, включая раковые клетки. Мы также описывают различные методы для проверки старения индукции. В частности мы сосредоточены на измерение активности лизосомальных ферментов старения-связанные β-галактозидазы (SA-β-gal), скорость синтеза ДНК с помощью 5-ethynyl-2′-дезоксиуридина (EdU) включение анализа уровней экспрессии клеточного цикла Ингибиторы p16 и p21 и выражение и секрецию членов Senescence-Associated секреторной фенотип (SASP). Наконец мы предоставляем пример результаты и обсудить дальнейшие применения этих протоколов.

Introduction

В 1961 году Хейфлик и Moorhead сообщили, что первичный фибробластов в культуре потерять их пролиферативный потенциал после последовательных проходов1. Этот процесс является причиной последовательных укорочение теломер после каждого деления клеток. Когда теломеры достигают критически короткой длины, они признаются в повреждения ДНК ответ (РДР), который активирует необратимым арест распространения — также определен как репликативной старение. Репликативной старения в настоящее время является одним из многих раздражителей, которые известны побудить государство ареста постоянного клеточного цикла, что делает клетки нечувствительны митогены и apoptotic сигналы2,3. Программа старения обычно характеризуются дополнительными функциями, включая высокую активность лизосомальных, митохондриальной дисфункции, ядерные изменения, перераспределений chromatin, эндоплазматического ретикулума стресс, повреждение ДНК и старение связанных секреторный фенотип (SASP)3,4. Стареющей клетки имеют несколько функций в организме: развития, ранение исцеления и опухоли подавления2. Кроме того они известны играть важную роль в старения и, как ни парадоксально, в прогрессии опухоли5. Отрицательный и частично противоречивой, эффекты старения часто приписывают SASP6.

Недавно было показано, что ликвидация стареющей клетки от мышей приводит к продлению жизни и ликвидации многих старения функции7,8,9,10,11, 12. в то же время, несколько препаратов были разработаны для либо устранить стареющей клетки (senolytics) или целевой SASP13,14. Антивозрастной лечебный потенциал недавно привлекло больше внимания к полю.

Изучение механизмов, связанных с сотовой старение и показы для фармакологического вмешательства сильно полагаться на ex vivo модели, особенно на первичной фибробластов. Хотя есть некоторые общие черты, активируются различные старение индукторов, большой изменчивости в старение фенотип наблюдаемыми и зависит от различных факторов, включая ячейки типа, стимулов и времени точки3,15, 16,17. Это необходимо учитывать гетерогенность для изучения и ориентации стареющей клетки. Таким образом этот протокол направлен на обеспечение ряда методов, используемых для вызывают старение в первичной фибробластов с помощью различных методов лечения. Как это будет объяснено, методы может быть легко адаптирована для других типов клеток.

Помимо репликативной старение, мы опишем пять других вызывающих старение лечения: ионизирующего излучения, ультрафиолетовые (УФ) излучения, доксорубицин, оксидативный стресс и эпигеномные изменения (а именно, поощрение ацетилирование гистона или деметилирования ДНК) . Ионизирующего излучения и УФ излучения вызывают прямого повреждения ДНК и, в соответствующих дозах вызывают старение18,19. Доксорубицин также вызывает старение главным образом через повреждения ДНК, интеркалирующие в ДНК и нарушая функцию топоизомеразы II и таким образом остановить ДНК ремонт механизмов20. Экспрессии генов, необходимых для старения обычно контролируется ацетилирование гистона и метилирования дна. Как следствие Ингибиторы гистоновых деацетилаз (например, натрия бутират и Саха) и ДНК-demethylating агентов (например, 5-Аза) вызывают старение в противном случае нормальных клеток21,22.

Наконец, четыре из наиболее распространенных маркеров, связанные для стареющей клетки будет объяснено: активность старение связанные β-галактозидазы (SA-β-gal), скорость синтеза ДНК, EdU включения анализа, гиперэкспрессия регуляторов клеточного цикла и p16 ингибиторы Циклин зависимая киназа p21, гиперэкспрессия и и секрецию членов SASP.

Protocol

1. Общая подготовка Подготовка среднего D10. Дополнить DMEM средне Glutamax с 10% FBS и 1% пенициллина/стрептомицина (конечная концентрация: 100 ед/мл). Подготовьте стерильные PBS. Растворите таблетки в воде в соответствии с инструкциями производителя. Стерилизуйте в автоклаве. Подгото…

Representative Results

Обогащение SA-β-Гал пятнать в стареющей фибробластов Β-галактозидазы (β-gal) является лизосомальных ферментов, которая выражается во всех клетках и который имеет оптимальный рН 4,025,26. Однако, во время старени?…

Discussion

Протоколы, описанные здесь были оптимизированы для первичной фибробластов, особенно BJ и WI-38 ячеек. Протоколы для репликативной старение, ионизирующего излучения и доксорубицина, успешно применялись к другим типам фибробластов (HCA2 и IMR90) и в других типах клеток (а именно новорожденным ме…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы благодарим членов Demaria лаборатории для плодотворных обсуждений и Thijmen ван Влит для совместного использования данных и протокол на УФ индуцированного старения.

Materials

DMEM Media – GlutaMAX Gibco 31966-047
Fetal Bovine Serum Hyclone SV30160.03
Penicillin-Streptomycin (P/S; 10,000 U/ml) Lonza DE17-602E
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich SC-202581
Nuclease-Free Water (not DEPC-Treated) Ambion AM9937
T75 flask Sarstedt 833911002
Trypsin/EDTA Solution Lonza CC-5012
PBS tablets Gibco 18912-014
1.5 ml microcentrifuge tubes Sigma-Aldrich T9661-1000EA
Corning 15 mL centrifuge tubes Sigma-Aldrich CLS430791
6-well plate Sarstedt 83.3920
24-well plate Sarstedt 83.3922
13mm round coverslips Sarstedt 83.1840.002
Steriflip Merck Chemicals SCGP00525
Cesium137-source IBL 637 Cesium-137γ-ray machine
UV radiation chamber Opsytec, Dr. Göbel BS-02
Doxorubicin dihydrochloride  BioAustralis Fine Chemicals BIA-D1202-1
Hydrogen peroxide solution Sigma-Aldrich 7722-84-1
5-aza-2’-deoxycytidine Sigma-Aldrich A3656
SAHA Sigma-Aldrich SML0061
Sodium Butyrate  Sigma-Aldrich B5887
X-gal (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside) Fisher Scientific 7240-90-6
Citric acid monohydrate Sigma-Aldrich 5949-29-1
Sodium dibasic phosphate Acros organics 7782-85-6
Potassium ferrocyanide  Fisher Scientific 14459-95-1
Potassium ferricyanide Fisher Scientific 13746-66-2
Sodium Chloride Merck Millipore 7647-14-5
Magnesium Chloride Fisher Chemicals 7791-18-6
25% glutaraldehyde Fisher Scientific 111-30-8,7732-18-5
16% formaldehyde (w/v) Thermo-Fisher Scientific 28908
EdU (5-ethynyl-2’-deoxyuridine) Lumiprobe 10540
Sulfo-Cyanine3 azide (Sulfo-Cy3-Azide) Lumiprobe D1330
Sodium ascorbate Sigma-Aldrich A4034
Copper(II) sulfate pentahydrate (Cu(II)SO4.5H2O) Sigma-Aldrich 209198
Triton X-100 Acros organics 215682500
TRIS base Roche 11814273001
LightCycler 480 Multiwell Plate 384, white  Roche 4729749001
Lightcycler 480 sealing foil  Roche 4729757001
Sensifast Probe Lo-ROX kit  Bioline BIO-84020
UPL Probe Library Sigma-Aldrich Various
Human IL-6 DuoSet ELISA R&D D6050
Bio-Rad TC20 Bio-Rad
Counting slides Bio-Rad 145-0017
Dry incubator Thermo-Fisher Scientific Heratherm
Dimethylformamide Merck Millipore 1.10983
Parafilm 'M' laboratory film Bemis  #PM992
Tweezers
Needles

References

  1. Hayflick, L., Moorhead, P. S. The serial cultivation of human diploid cell strains. Experimental Cell Research. 25, 585-621 (1961).
  2. Muñoz-Espín, D., Serrano, M. Cellular senescence: from physiology to pathology. Nature reviews. Molecular cell biology. 15, 482-496 (2014).
  3. Sharpless, N. E., Sherr, C. J. Forging a signature of in vivo senescence. Nature Reviews Cancer. 15 (7), 397-408 (2015).
  4. Correia-Melo, C., et al. Mitochondria are required for pro-ageing features of the senescent phenotype. The EMBO Journal. 10, e201592862 (2016).
  5. Loaiza, N., Demaria, M. Cellular senescence and tumor promotion: Is aging the key?. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Reviews on Cancer. , (2016).
  6. Coppe, J. P., et al. Senescence-associated secretory phenotypes reveal cell-nonautonomous functions of oncogenic RAS and the p53 tumor suppressor. PLoS Biology. 6 (12), 2853-2868 (2008).
  7. Baker, D. J., et al. Naturally occurring p16(Ink4a)-positive cells shorten healthy lifespan. Nature. 530 (7589), 184-189 (2016).
  8. Xu, M., et al. Targeting senescent cells enhances adipogenesis and metabolic function in old age. Elife. 4, e12997 (2015).
  9. Baker, D. J., et al. Clearance of p16Ink4a-positive senescent cells delays ageing-associated disorders. Nature. 479 (7372), 232-236 (2011).
  10. Jeon, O. H., et al. Local clearance of senescent cells attenuates the development of post-traumatic osteoarthritis and creates a pro-regenerative environment. Nature Medicine. 23 (6), 775-781 (2017).
  11. Demaria, M., et al. Cellular Senescence Promotes Adverse Effects of Chemotherapy and Cancer Relapse. Cancer Discovery. 7 (2), 165-176 (2017).
  12. Chang, J., et al. Clearance of senescent cells by ABT263 rejuvenates aged hematopoietic stem cells in mice. Nature Medicine. 22 (1), 78-83 (2016).
  13. Soto-Gamez, A., Demaria, M. Therapeutic interventions for aging: the case of cellular senescence. Drug Discov Today. 22 (5), 786-795 (2017).
  14. Childs, B. G., et al. Senescent cells: an emerging target for diseases of ageing. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (10), 718-735 (2017).
  15. Marthandan, S., et al. Conserved genes and pathways in primary human fibroblast strains undergoing replicative and radiation induced senescence. Biological Research. 49, 34 (2016).
  16. Marthandan, S., et al. Conserved Senescence Associated Genes and Pathways in Primary Human Fibroblasts Detected by RNA-Seq. PLoS One. 11 (5), e0154531 (2016).
  17. Hernandez-Segura, A., et al. Unmasking Transcriptional Heterogeneity in Senescent Cells. Current Biology. 27 (17), 2652-2660 (2017).
  18. Le, O. N., et al. Ionizing radiation-induced long-term expression of senescence markers in mice is independent of p53 and immune status. Aging Cell. 9 (3), 398-409 (2010).
  19. Hall, J. R., et al. C/EBPalpha regulates CRL4(Cdt2)-mediated degradation of p21 in response to UVB-induced DNA damage to control the G1/S checkpoint. Cell Cycle. 13 (22), 3602-3610 (2014).
  20. Nitiss, J. L. Targeting DNA topoisomerase II in cancer chemotherapy. Nature Reviews Cancer. 9 (5), 338-350 (2009).
  21. Pazolli, E., et al. Chromatin remodeling underlies the senescence- associated secretory phenotype of tumor stromal fibroblasts that supports cancer progression. Cancer Research. 72, 2251-2261 (2012).
  22. Venturelli, S., et al. Differential induction of apoptosis and senescence by the DNA methyltransferase inhibitors 5-azacytidine and 5-aza-2′-deoxycytidine in solid tumor cells. Molecular Cancer Therapeutics. 12, 2226-2236 (2013).
  23. Tennant, J. R. Evaluation of the Trypan Blue Technique for Determination of Cell Viability. Transplantation. 2, 685-694 (1964).
  24. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  25. Lee, B. Y., et al. Senescence-associated β-galactosidase is lysosomal β-galactosidase. Aging Cell. 5, 187-195 (2006).
  26. Kopp, H. G., Hooper, A. T., Shmelkov, S. V., Rafii, S. Beta-galactosidase staining on bone marrow. The osteoclast pitfall. Histology and Histopathology. 22 (9), 971-976 (2007).
  27. Dimri, G. P., et al. A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (20), 9363-9367 (1995).
  28. Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (7), 2415-2420 (2008).
  29. Sherr, C. J., McCormick, F. The RB and p53 pathways in cancer. Cancer Cell. 2 (2), 103-112 (2002).
  30. Bunz, F., et al. Requirement for p53 and p21 to sustain G2 arrest after DNA damage. Science. 282 (5393), 1497-1501 (1998).
  31. Severino, J., Allen, R. G., Balin, S., Balin, A., Cristofalo, V. J. Is beta-galactosidase staining a marker of senescence in vitro and in vivo. Experimental Cell Research. 257 (1), 162-171 (2000).
  32. Stolzing, A., Coleman, N., Scutt, A. Glucose-induced replicative senescence in mesenchymal stem cells. Rejuvenation Research. 9 (1), 31-35 (2006).
  33. Blazer, S., et al. High glucose-induced replicative senescence: point of no return and effect of telomerase. Biochemical and Biophysical Research Communications. 296 (1), 93-101 (2002).
  34. Wiley, C. D., Campisi, J. From Ancient Pathways to Aging Cells-Connecting Metabolism and Cellular Senescence. Cell Metabolism. 23 (6), 1013-1021 (2016).
  35. Kumar, R., Gont, A., Perkins, T. J., Hanson, J. E. L., Lorimer, I. A. J. Induction of senescence in primary glioblastoma cells by serum and TGFbeta. Scientific Reports. 7 (1), 2156 (2017).
  36. Hypoxia Blagosklonny, M. V. MTOR and autophagy: converging on senescence or quiescence. Autophagy. 9 (2), 260-262 (2013).
  37. Meuter, A., et al. Markers of cellular senescence are elevated in murine blastocysts cultured in vitro: molecular consequences of culture in atmospheric oxygen. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 31 (10), 1259-1267 (2014).
  38. Coppe, J. P., et al. A human-like senescence-associated secretory phenotype is conserved in mouse cells dependent on physiological oxygen. PLoS One. 5 (2), e9188 (2010).
  39. van Deursen, J. M. The role of senescent cells in ageing. Nature. 509 (7501), 439-446 (2014).
  40. Kim, Y. M., et al. Implications of time-series gene expression profiles of replicative senescence. Aging Cell. 12, 622-634 (2013).

Play Video

Cite This Article
Hernandez-Segura, A., Brandenburg, S., Demaria, M. Induction and Validation of Cellular Senescence in Primary Human Cells. J. Vis. Exp. (136), e57782, doi:10.3791/57782 (2018).

View Video