Eine kombinatorische einzellige Ansatz zur molekularen Charakterisierung und Immunophenotypic Heterogenität der menschlichen Stammzellen und Vorläuferzellen Populationen
Summary
Bulk-gen Ausdruck Messungen Wolke Einzelzelle Unterschiede in heterogenen Zellpopulationen. Hier beschreiben wir ein Protokoll wie einzellige gen Expressionsanalyse und Index Sortierung durch die Blüte aktiviert Zelle sortieren (FACS) kann kombiniert werden, um die Heterogenität zu umreißen und immunophenotypisch charakterisieren molekular unterschiedliche Zellpopulationen.
Abstract
Immunophenotypic Charakterisierung und molekulare Analyse haben seit langem verwendet, um abzugrenzen Heterogenität und unterschiedliche Zellpopulationen zu definieren. FACS ist von Natur aus eine einzellige Assay, molekulare Analyse jedoch vor, die Zielzellen oft prospektiv in loser Schüttung, isoliert werden dadurch verlieren einzellige Auflösung. Einzellige gen Expressionsanalyse bietet die Möglichkeit, molekulare Unterschiede zwischen einzelnen Zellen in heterogenen Zellpopulationen zu verstehen. In Zelle Massenanalyse ergibt eine Überrepräsentation von einem deutlichen Zelltyp Vorurteile und Gefäßverschlüsse von Signalen von seltenen Zellen mit biologischer Bedeutung. Durch die Verwendung von FACS Index sortieren gekoppelt mit einzelligen gen Expressionsanalyse, Populationen untersucht werden können ohne den Verlust von einzelligen Auflösung während Zellen mit mittleren Zelle Oberfläche Marker Ausdruck auch erfasst werden, ermöglichen die Bewertung der die Relevanz der kontinuierliche Oberfläche Marker Ausdruck. Hier beschreiben wir einen Ansatz, der reversen Transkription einzellige kombiniert quantitative PCR (RT-qPCR) und FACS index sortieren gleichzeitig die molekulare Charakterisierung und Immunophenotypic Heterogenität innerhalb Zell-Populationen.
Im Gegensatz zu den einzelligen RNA Sequenzierung Methoden ermöglicht die Verwendung von qPCR mit zielgruppenspezifischen Verstärkung für robuste Messungen von niedrig-Fülle Transkripte mit weniger Aussetzer, während es durch Probleme im Zusammenhang mit Variationen von Zelle zu Zelle lesen Sie nicht verwechselt wird Tiefe. Darüber hinaus direkt Index-Sortierung Einzel-Zellen in Lyse-diese Methode Puffer, ermöglicht durch cDNA Synthese und zielgruppenspezifische Vorverstärkung in einem Schritt sowie für die Korrelation der später abgeleiteten molekulare Signaturen mit Zelloberfläche durchgeführt werden Marker-Ausdruck. Die beschriebene Vorgehensweise wurde entwickelt, um hämatopoetischen Einzel-Zellen zu untersuchen, aber haben auch erfolgreich auf andere Zelltypen eingesetzt.
Abschließend ermöglicht der hierin beschriebene Ansatz für empfindliche Messung der mRNA Ausdruck für ein Panel der vorgewählten Gene mit der Möglichkeit, Protokolle für angehende isoliert von molekular unterschiedliche Subpopulationen zu entwickeln.
Introduction
Jede einzelne Blutzelle wird geglaubt, um in einer zellulären Hierarchie befinden wo Stammzellen bilden die Spitze auf der Oberseite eine Reihe von zunehmend engagierte fortgeschrittene Stammväter, die schließlich unheilbar in die endgültige Effektorzellen mit spezifischen unterscheiden biologische Funktionen1. Viel von dem Wissen über Stammzellen Systeme wie organisiert sind wurde im blutbildenden System, vor allem wegen der Fähigkeit, unterschiedliche hämatopoetische Populationen hochangereichertes für Stammzellen oder verschiedene Vorfahren2 prospektiv isolieren generiert durch FACS sortieren. Dies hat für viele dieser Populationen erlaubt, funktional oder molekular, überwiegend durch gen-Expressions-profiling3,4analysiert werden. Aber wenn Analyse der Genexpression von Schüttgut Populationen individuelle Unterschiede zwischen den Zellen sind gemittelt und verlor5. So kann Arbeitsunfähigkeit, Zell-Zell-Varianten in heterogenen Zelle Bruchteilen zu erkennen unser Verständnis der kritischen biologischen Prozesse verwirren, wenn kleine Teilmengen von Zellen für die abgeleitete biologische Funktion von dieser Bevölkerung6zu berücksichtigen, 7. Umgekehrt, Untersuchung von gen-Ausdruck-Signaturen bei einzelligen Auflösung bieten die Möglichkeit zu Heterogenität abzugrenzen und zu überschatten Einflüsse aus überrepräsentiert Teilmengen von Zellen8umgehen.
Bisher wurden viele Protokolle für einzellige gen Expressionsanalyse entwickelt; mit jeder dieser Ansätze hat seine eigenen Vorbehalte. Die früheste Methode wurde RNA Fluoreszenz in Situ Hybridisierung (RNA-Fisch), die eine begrenzte Anzahl von Abschriften zu einem Zeitpunkt misst, sondern ist einzigartig, da es ermöglicht die Untersuchung von RNA Lokalisierung9,11. Frühe Methoden mittels PCR und qPCR um zu erkennen, dass ein einzelnes oder wenige Abschriften wurden auch entwickelt,12. Jedoch haben diese in letzter Zeit durch Mikrofluidik-basierte Methoden ersetzt, die gleichzeitig Ausdruck von Hunderten von Abschriften pro Zelle in Hunderten von Zellen durch qPCR analysieren können und ermöglichen so hochdimensionalen Heterogenität-Analyse mit gen Platten10,13im Vorhinein festgelegt. Vor kurzem RNA Sequenzierung basierenden Technologien haben werden am meisten benutzt für Einzelzelle Analyse, wie diese können theoretisch das ganze Transkriptom einer Zelle zu messen und dadurch eine explorative Dimension Heterogenität Analyse10, verleihen 14. Multiplexed qPCR Analyse und einzellige RNA Sequenzierung haben unterschiedliche Eigenschaften, so die Begründung für die Verwendung einer der Methoden hängt die Frage sowie die Anzahl der Zellen in der Zielpopulation. Hochdurchsatz- und low-cost pro Zelle zusammen mit unvoreingenommenen, explorative Eigenschaften der einzelligen RNA Sequenzierung sind erwünscht, wenn unbekannte Zelle oder große Populationen untersucht werden. Allerdings ist einzellige RNA Sequenzierung auch voreingenommen gegenüber Sequenzierung hohe reichliche Abschriften häufiger während Transkripte mit niedrigen Fülle anfällig für Ausfälle sind. Dies führt zu erheblich komplexer Daten, das stellt hohe Anforderungen an bioinformatische Analyse wichtige molekulare Signale zeigen, die oft subtil oder in technischen Lärm15verborgen sind. Also für gut charakterisierten Gewebe einzellige qPCR-Analyse mit vorbestimmt Primer Platten ausgewählt für funktionell wichtige Gene oder molekulare Marker können als ein sensibler, unkomplizierte Konzept zur Bestimmung der Heterogenität der dienen ein Bevölkerung. Allerdings ist anzumerken, dass im Vergleich zu einzellige RNA-FF, die Kosten pro Zelle ist im Allgemeinen höher für einzellige qPCR Methoden. Hier beschreiben wir einen Ansatz, der einzelligen RT-qPCR (geändert von Teles J. Et Al. kombiniert ( 16), FACS Index gleichzeitig17 und Bioinformatik Analyse18 zur Sortierung die molekularen und Immunophenotypic Heterogenität innerhalb von Populationen zu charakterisieren.
Bei diesem Ansatz die Zellpopulation des Interesses ist befleckt und Einzel-Zellen sind durch FACS direkt in Lyse Puffer in 96-Well-PCR-Platten sortiert. Gleichzeitig sind Ausdruck eines zusätzlichen Satzes der Zelloberfläche Marker für jede einzelne Zelle bei der FACS-Sortierung, eine Methode Drittel über dem Niveau, die als Index-Sortierung bezeichnet wird. Das lysierten Zellmaterial wird anschließend verstärkt und die Genexpression eine ausgewählte Gruppe von Genen mit RT-qPCR, mithilfe einer mikrofluidischen Plattform analysiert. Diese Strategie ermöglicht molekulare Analyse der sortierten einzellige sowie gleichzeitige Charakterisierung von jeder einzelnen Zelle Zelloberfläche Marker Ausdruck. Indem Sie direkt zuordnen molekular unterschiedliche Teilmengen von Zellen des Ausdrucks der indizierten sortierte Marker, können die Subpopulationen mit einer bestimmten Immunophenotype verknüpft werden, die für ihre zukünftigen Isolation verwendet werden können. Die Methode wird erläutert Schritt für Schritt in Abbildung 1. Eine vorbestimmte gen Gremium trägt eine höhere Auflösung der gezielten Genexpression, da sie Messung irrelevant reichlich Gene umgeht, die sonst feine gen Ausdruck Signale verdecken können. Robuste Messung von niedrigen ausgedrückt Transkripte, wie Transkriptionsfaktoren oder nicht-Poly-Adenylated-RNAs ermöglicht darüber hinaus der zielgruppenspezifischen Verstärkung, einen Schritt reversen Transkription und Verstärkung. Wichtig ist, zulassen qPCR Methoden für die Messung der mRNA von Schmelzverfahren Proteine, die wichtig sind bei der Untersuchung von bestimmten bösartigen Erkrankungen19. Zu guter Letzt die fokussierte Zahl der Gene untersucht, geringe Drop-out-Raten und begrenzten technischen Unterschiede zwischen den Zellen machen diese Methode leicht analysiert im Vergleich zu höher dimensionale Methoden, z. B. einzellige RNA-seq. Anhand des Protokolls kann eine gesamte Experiment durchgeführt werden, von der Sortierung Zellen analysierten Ergebnisse innerhalb von drei Tagen, so dass dies eine unkomplizierte und schnelle Methode für sensible, Hochdurchsatz einzellige Ausdruck Genanalyse.
Protocol
Representative Results
Discussion
In den letzten Jahren ist Ausdruck von einzelligen Genanalyse eine wertvolle Ergänzung zu definieren, die Heterogenität der einzelnen Zelle Bevölkerungen23geworden. Das Aufkommen der RNA Sequenziertechnologien theoretisch bietet die Möglichkeit, das gesamte Transkriptom einer Zelle zu messen, aber diese Methoden durch Variationen in tiefen von Zelle zu Zelle Sequenzierung und Aussteiger kompliziert sind. Einzellige qPCR bietet eine sensible und robuste Analyse des Ausdrucks von Hunderten von k…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wird durch Zuschüsse vom schwedischen Krebsgesellschaft, The Swedish Research Council, der schwedischen Gesellschaft für medizinische Forschung, die schwedische Kinderkrebsstiftung, die Ragnar Söderberg Foundation, und The Knut und Alice Wallenberg Foundation unterstützt.
Materials
| CD14 PECY5 | eBioscience | 15-0149-42 | Clone: 61D3 |
| CD16 PECY5 | Biolegend | 302010 | Clone: 3G8 |
| CD56 PECY5 | Biolegend | 304608 | Clone: MEM-188 |
| CD19 PECY5 | Biolegend | 302210 | Clone: HIB19 |
| CD2 PECY5 | Biolegend | 300210 | Clone: RPA-2.10 |
| CD3 PECY5 | Biolegend | 300310 | Clone: HIT3a |
| CD123 PECY5 | Biolegend | 306008 | Clone: 6H6 |
| CD235A PECY5 | BD Pharma | 559944 | Clone GAR2 |
| CD34 FITC | Biolegend | 343604 | Clone: 561 |
| CD38 APC | Biolegend | 303510 | Clone: Hit2 |
| CD90 PE | Biolegend | 328110 | Clone: 5E10 |
| CD45RA BV421 | BD bioscience | 560362 | Clone: HI100 |
| CD49f Pecy7 | eBioscience | 25-0495-82 | Clone: eBioGOH3 |
| FBS | HyClone | SV30160.3 | |
| PBS | HyClone | SH30028.02 | |
| 96-well u-bottom Plate | VWR | 10861-564 | |
| SFEM | Stem cell technologies | 9650 | |
| Penicillin streptomycin | HyClone | SV30010 | |
| TPO | Peprotech | 300-18 | |
| SCF | Peprotech | 300-07 | |
| FLT3L | Peprotech | 300-19 | |
| Falcon Tube 15 mL | Sarstedt | 62.554.502 | |
| Eppendorph tube | Sarstedt | 72.690.001 | |
| CST beads | BD | 642412 | |
| Accudrop Beads | BD | 345249 | 6-µm particles |
| Adhesive film Clear | Thermo scientific | AB-1170 | |
| Adhesive film Foil | Thermo scientific | AB-0626 | |
| 96 well PCR plate | Axygen | PCR-96M2-HS-C | |
| PCR 1.5 mL tube | Axygen | MCT-150-L-C | |
| T100 PCR cycler | BioRad | 186-1096 | |
| 10% NP40 | Thermo scientific | 85124 | |
| 10mM dNTP | Takara | 4030 | |
| 0.1M DTT | Invitrogen | P2325 | |
| RNAsout | Invitrogen | 10777-019 | RNAse inhibitor |
| CellsDirect One-Step qRT-PCR Kit | Invitrogen | 11753-100 | |
| Neuclease free water | Invitrogen | 11753-100 | from CellsDirect kit |
| 2X Reaction Mix | Invitrogen | 11753-100 | from CellsDirect kit |
| SuperScript III RT/Platinum Taq Mix | Invitrogen | 11753-100 | from CellsDirect kit |
| Platinum Taq DNA Polymerase | Invitrogen | 10966026 | |
| TaqMan Cells-to-CT Control Kit | Invitrogen | 4386995 | |
| Xeno RNA Control | Invitrogen | 4386995 | From TaqMan Cells-to-CT Control Kit |
| 20X Xeno RNA Control Taqman Gene Expression Assay | Invitrogen | 4386995 | From TaqMan Cells-to-CT Control Kit |
| 96.96 Sample/Loading Kit—10 IFCs | Fluidigm | BMK-M10-96.96 | |
| 2X Assay Loading Reagent | Fluidigm | From 96.96 Sample/Loading Kit | |
| 20X GE Sample Loading Reagent | Fluidigm | From 96.96 Sample/Loading Kit | |
| Control line fluid | Fluidigm | From 96.96 Sample/Loading Kit | |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | Applied Biosystems | 4369016 | |
| BioMark HD | Fluidigm | BMKHD-BMKHD | |
| 96.96 Dynamic Array IFC | Fluidigm | BMK-M10-96.96GT | |
| Excel | Microsoft | Microsoft | |
| FlowJo V10 | TreeStar | TreeStar | |
| Fluidigm real time PCR analysis | Fluidigm | Fluidigm | |
| CD179a.VPREB1 | Thermofisher scientific | Hs00356766_g1 | |
| ACE | Thermofisher scientific | Hs00174179_m1 | |
| AHR | Thermofisher scientific | Hs00169233_m1 | |
| BCR_ABL.52 | Thermofisher scientific | Hs03043652_ft | |
| BCR_ABL41 | Thermofisher scientific | Hs03024541_ft | |
| BMI1 | Thermofisher scientific | Hs00995536_m1 | |
| CCNA2 | Thermofisher scientific | Hs00996788_m1 | |
| CCNB1 | Thermofisher scientific | Hs01030099_m1 | |
| CCNB2 | Thermofisher scientific | Hs01084593_g1 | |
| CCNC | Thermofisher scientific | Hs01029304_m1 | |
| CCNE1 | Thermofisher scientific | Hs01026535_g1 | |
| CCNF | Thermofisher scientific | Hs00171049_m1 | |
| CCR9 | Thermofisher scientific | Hs01890924_s1 | |
| CD10.MME | Thermofisher scientific | Hs00153510_m1 | |
| CD11a | Thermofisher scientific | Hs00158218_m1 | |
| CD11c.ITAX | Thermofisher scientific | Hs00174217_m1 | |
| CD123.IL3RA | Thermofisher scientific | Hs00608141_m1 | |
| CD133.PROM1 | Thermofisher scientific | Hs01009250_m1 | |
| CD151 | Thermofisher scientific | Hs00911635_g1 | |
| CD220.INSR | Thermofisher scientific | Hs00961554_m1 | |
| CD24.HSA | Thermofisher scientific | Hs03044178_g1 | |
| NCOR1 | Thermofisher scientific | Hs01094540_m1 | |
| CD26.DPP4 | Thermofisher scientific | Hs00175210_m1 | |
| CD274 | Thermofisher scientific | Hs01125301_m1 | |
| CD276 | Thermofisher scientific | Hs00987207_m1 | |
| CD32.FCGR2B | Thermofisher scientific | Hs01634996_s1 | |
| CD33 | Thermofisher scientific | Hs01076281_m1 | |
| CD34 | Thermofisher scientific | Hs00990732_m1 | |
| CD344.FZD4 | Thermofisher scientific | Hs00201853_m1 | |
| CD352.SLAMF6 | Thermofisher scientific | Hs01559920_m1 | |
| CD38 | Thermofisher scientific | Hs01120071_m1 | |
| CD4 | Thermofisher scientific | Hs01058407_m1 | |
| CD41.ITGA2B | Thermofisher scientific | Hs01116228_m1 | |
| CD49f.ITGA6 | Thermofisher scientific | Hs01041011_m1 | |
| CD56.NCAM1 | Thermofisher scientific | Hs00941830_m1 | |
| CD9 | Thermofisher scientific | Hs00233521_m1 | |
| CD97 | Thermofisher scientific | Hs00173542_m1 | |
| CD99 | Thermofisher scientific | Hs00908458_m1 | |
| CDK6 | Thermofisher scientific | Hs01026371_m1 | |
| CDKN1A | Thermofisher scientific | Hs00355782_m1 | |
| CDKN1B | Thermofisher scientific | Hs01597588_m1 | |
| CDKN1C | Thermofisher scientific | Hs00175938_m1 | |
| CEBPa | Thermofisher scientific | Hs00269972_s1 | |
| CSF1r | Thermofisher scientific | Hs00911250_m1 | |
| CSF2RA | Thermofisher scientific | Hs00531296_g1 | |
| CSF3RA | Thermofisher scientific | Hs01114427_m1 | |
| E2A.TCF3 | Thermofisher scientific | Hs00413032_m1 | |
| EBF1 | Thermofisher scientific | Hs01092694_m1 | |
| ENG | Thermofisher scientific | Hs00923996_m1 | |
| EPOR | Thermofisher scientific | Hs00959427_m1 | |
| ERG | Thermofisher scientific | Hs01554629_m1 | |
| FLI1 | Thermofisher scientific | Hs00956711_m1 | |
| FLT3 | Thermofisher scientific | Hs00174690_m1 | |
| FOXO1 | Thermofisher scientific | Hs01054576_m1 | |
| GAPDH | Thermofisher scientific | Hs02758991_g1 | |
| GATA1 | Thermofisher scientific | Hs00231112_m1 | |
| GATA2 | Thermofisher scientific | Hs00231119_m1 | |
| GATA3 | Thermofisher scientific | Hs00231122_m1 | |
| GFI1 | Thermofisher scientific | Hs00382207_m1 | |
| HES1 | Thermofisher scientific | Hs01118947_g1 | |
| HLF | Thermofisher scientific | Hs00171406_m1 | |
| HMGA2 | Thermofisher scientific | Hs00171569_m1 | |
| HOXA5 | Thermofisher scientific | Hs00430330_m1 | |
| HOXB4 | Thermofisher scientific | Hs00256884_m1 | |
| ID2 | Thermofisher scientific | Hs04187239_m1 | |
| IGF2BP1 | Thermofisher scientific | Hs00198023_m1 | |
| IGF2BP2 | Thermofisher scientific | Hs01118009_m1 | |
| IKZF1 | Thermofisher scientific | Hs00172991_m1 | |
| IL1RAP | Thermofisher scientific | Hs00895050_m1 | |
| IL2RG | Thermofisher scientific | Hs00953624_m1 | |
| IRF8 | Thermofisher scientific | Hs00175238_m1 | |
| ITGB7 | Thermofisher scientific | Hs01565750_m1 | |
| KIT | Thermofisher scientific | Hs00174029_m1 | |
| Lin28B | Thermofisher scientific | Hs01013729_m1 | |
| LMO2 | Thermofisher scientific | Hs00153473_m1 | |
| LYL1 | Thermofisher scientific | Hs01089802_g1 | |
| Meis1 | Thermofisher scientific | Hs01017441_m1 | |
| mKi67 | Thermofisher scientific | Hs01032443_m1 | |
| MPL | Thermofisher scientific | Hs00180489_m1 | |
| MPO | Thermofisher scientific | Hs00924296_m1 | |
| NFIB | Thermofisher scientific | Hs01029175_m1 | |
| Notch1 | Thermofisher scientific | Hs01062011_m1 | |
| Pten | Thermofisher scientific | Hs02621230_s1 | |
| RAG2 | Thermofisher scientific | Hs01851142_s1 | |
| RPS18 | Thermofisher scientific | Hs01375212_g1 | |
| RUNX1 | Thermofisher scientific | Hs00231079_m1 | |
| Shisa2 | Thermofisher scientific | Hs01590823_m1 | |
| Spi1 | Thermofisher scientific | Hs02786711_m1 | |
| Sterile.IgH | Thermofisher scientific | Hs00378435_m1 | |
| TAL1 | Thermofisher scientific | Hs01097987_m1 | |
| THY1 | Thermofisher scientific | Hs00264235_s1 | |
| Tim.3.HAVCR2 | Thermofisher scientific | Hs00958618_m1 | |
| VWF | Thermofisher scientific | Hs00169795_m1 |
References
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