분자 특성 조합 단일 셀 접근 및 인간의 줄기 및 조상 인구 Immunophenotypic이
Summary
대량 유전자 식 측정 클라우드 개별 셀 차이 이종 세포 인구에서. 여기, 우리는 프로토콜 설명 어떻게 단일 셀 유전자 표정 분석 및 인덱스에 대 한 분류로 개화 활성화 셀 정렬 (FACS)이 윤곽을 그리 다 결합 될 수 있다 및 immunophenotypically 특성 분자로 뚜렷한 세포 인구.
Abstract
Immunophenotypic 특성 및 분자 분석이 윤곽을 그리 다 뚜렷한 세포 인구를 정의 하 오랫동안 사용 되어 왔습니다. 그러나 FACS은 본질적으로 단일 세포 분석 실험, 분자 분석 하기 전에, 대상 셀은 종종 prospectively 절연 되어 대량, 따라서 단일 셀 해상도 잃고. 단일 셀 유전자 표정 분석 이종 세포 인구에 있는 개별 셀 사이의 분자 차이 이해 하는 수단을 제공 합니다. 대량 세포 분석에서 고유한 셀 형식의 overrepresentation 생물 학적 중요성으로 편견 및 희소 한 세포에서 신호 않기에 결과. FACS 인덱스 정렬 단일 셀 유전자 표정 분석을 결합 하 여 인구 조사 수 단일 셀 해상도의 손실 없이 중간 세포 표면 마커 식 세포 또한 점령 하 고, 하는 동안 평가 활성화 연속 표면 마커 식의 관련성입니다. 여기, 우리는 단일 셀 반전 녹음 방송 결합 하는 접근 방식을 설명 정량 PCR (RT-정량) 및 FACS 색인 동시에 분자의 특성을 정렬 하 고 셀 인구 내의 immunophenotypic이.
단일 셀 RNA 시퀀싱 방법, 달리 특정 대상 증폭 정량 Pcr 사용 하 여 동안 수 있습니다 적은 낙후, 낮은 풍부 성적표의 강력한 측정 셀 변화에 읽기에 관련 된 문제에 의해 혼동 하지는 깊이입니다. 또한,에 의해 직접 인덱스 정렬 단일-세포 세포의 용 해로,이 방법은 버퍼 수 있게 cDNA 합성 및 특정 대상 사전 증폭 세포 표면 분자 서명 이후에 파생된의 상관 관계 뿐만 아니라 한 단계에서 수행할 수 표식 식입니다. 기술된 접근, 조 혈 단일 세포를 조사 하지만 또한 다른 세포 유형에 성공적으로 사용 되었습니다 개발 되었습니다.
끝으로, 여기에 설명 된 접근 분자로 별개 부분 모집단의 후속 예비 격리 프로토콜을 개발 하 패널에 대 한 가능성과 함께 미리 선택 된 유전자의 mRNA 표현의 중요 한 측정에 대 한 수 있습니다.
Introduction
각 개별 혈액 세포 어디 줄기 세포 형성 결국 말기 특정 들고 최종 효과 기 세포로 분화 하는 점점 더 최선을 다하고 중간 창시자의 시리즈 위에 정점 세포 계층 구조에서 것으로 생각 됩니다. 생물 학적 기능1. 줄기 세포 시스템 구성 방식에 대 한 지식을 많이 크게 능력을 고도로 농축 줄기 세포 또는 다양 한 창시자2 가지 조 혈 인구 prospectively 분리 때문에 조 혈 시스템에 생성 된 FACS 정렬. 이 분석 기능 또는 분자로, 주로 유전자 발현 프로 파일링3,4를 통해 이러한 인구의 많은 수 있다. 그러나 때 대량 인구 개별 차이 세포의 유전자 발현을 분석은 평균 밖으로 하 고5를 잃었다. 따라서, 이기종 셀 분수 내 셀 변화를 감지 하는 무능 경우 셀의 작은 하위 집합 그 인구6,의 유추 생물 학적 기능에 대 한 중요 한 생물 학적 과정에 대 한 우리의 이해 혼동 수 있습니다. 7. 반대로, 유전자 식 서명 단일 셀 해상도 조사가 윤곽을 그리 다 셀8overrepresented 하위 집합에서가 영향을 회피 하는 가능성을 제공.
현재까지 단일 셀 유전자 표정 분석을 위한 많은 프로토콜 개발 되었습니다; 각 접근 자체 주의 데. 가장 이른 방법은 이었다 RNA 형광 제자리에서 교 잡 (RNA-물고기), 한 번에 제한 된 수의 성적을 측정 하지만 독특한 RNA 지역화9,11의 조사에 대 한 수 있습니다. 단일 또는 거의 기록 했다 또한 감지를 PCR과 정량 Pcr를 사용 하 여 초기 방법 개발12. 그러나,이 요즘 대체 되었습니다 동시에 정량 셀의 수백에 셀 당 증명서의 수백의 식을 분석 하 고 따라서 높은 차원이 분석을 사용 하 여 허용 수 있는 마이크로-기반 방법으로 사전 결정 유전자 패널10,13. 최근 RNA 시퀀싱 기반 기술을 널리 사용이 될 단일 세포 분석을 위해 이러한 이론적으로 수 셀의 전체 transcriptome 측정 하 고 그로 인하여 추가 답사 차원이 분석10, 14. Multiplexed 정량 분석 및 단일 셀 RNA 시퀀싱 다른 기능을가지고, 따라서 방법 중 하나를 사용 하 여에 대 한 근거는 타깃 셀의 수 뿐만 아니라 질문에 따라 달라 집니다. 높은 처리량 및 단일 셀 RNA 시퀀싱의 편견, 탐구 특성 함께 셀 당 저가 알 수 없는 셀 또는 큰 인구 조사 때 바람직한. 그러나, 단일 셀 RNA 시퀀싱은 또한 낮은 풍부와 성적 증명서는 중단 하는 경향이 높은 풍부한 성적표를 더 자주 시퀀싱으로 편 파. 이 종종 미묘한 또는 기술적인 잡음15에 숨겨진 중요 한 분자 신호를 공개 bioinformatic 분석에 높은 수요를 상당히 복잡 한 데이터 발생할 수 있습니다. 따라서, 잘 특징이 조직에 대 한 단일 셀 정량 분석을 사용 하 여 미리 결정 뇌관 패널 기능적으로 중요 한 유전자 또는 분자 마커 선택의 질을 결정 하는 민감한, 간단한 접근 될 수 있는 인구입니다. 그러나, 주목 해야 한다 그에 비해 단일 셀 RNA-seq, 셀 당 비용은 단일 셀 정량 방법에 대 한 일반적으로 더 높은. 여기, 우리가 결합 하 여 단일 셀 실시간 정량 Pcr (Teles J. 그 외 여러분 에서 수정 하는 방법 설명 16), FACS 인덱스 인구 내에서 분자와 immunophenotypic이 특징에17 및 생물 정보학 분석18 를 동시에 정렬.
이 방법에서는, 관심사의 세포 인구, 스테인드 그리고 단일 세포 세포의 용 해 버퍼 96 잘 PCR 접시에서에 직접 FACS에 의해 정렬 됩니다. 동시에, 세포 표면 마커 추가 집합 식 수준의 FACS 라고 인덱스 정렬 방법-정렬, 하는 동안 각 단일 셀에 대 한 기록 됩니다. Lysed 세포 물자는 연속적으로 증폭 하 고 실시간 정량, 미세 플랫폼을 사용 하 여 선택된 된 유전자의 유전자 발현 분석. 이 전략에는 각 개별 셀의 세포 표면 마커 식의 정렬 된 단일 셀으로 동시 특성화의 분자 분석 수 있습니다. 직접 인덱스 정렬 된 표시자의 식 세포의 분자로 고유 하위 집합을 매핑하여,를 모집단 그들의 잠재 격리에 대 한 사용할 수 있는 특정 immunophenotype에 연결할 수 있습니다. 메서드를 설명 하는 그림 1에서 단계적으로. 미리 정해진된 유전자 패널 더 미묘한 유전자 식 신호를 가리고 그렇지 않으면 수 없는 풍부한 유전자의 측정 circumvents 이후 타겟된 유전자 발현의 높은 해상도에 기여 한다. 또한, 특정 대상 확대, 한 단계 반전 녹음 방송, 그리고 증폭 녹음 방송 요인 또는 비 폴 리 adenylated RNAs 같은 낮은 표현된 성적표의 강력한 측정에 대 한 수 있습니다. 중요 한 것은, 정량 방법에서 특정 악성 질병19를 조사할 때 중요 한 융해 단백질 mRNA의 측정에 대 한 수 있습니다. 마지막으로, 유전자의 집중된 수 조사, 낮은 드롭 아웃 요금, 및 제한 된 셀 확인이이 방법은 쉽게 분석 기술 차이 단일 셀 RNA-이 같은 높은 차원 방법에 비해 프로토콜에 따라, 전체 실험 수행할 수 있습니다, 정렬 셀 분석된 결과를 3 일 이내 중요 한, 높은 처리량 단일 셀 유전자 표정 분석에 대 한 단순 하 고 빠른 방법 만들기에서.
Protocol
Representative Results
Discussion
최근 몇 년 동안, 단일 셀 유전자 표정 분석은 다양 한 세포 인구23의 정의에 가치 추가 되었다. 그러나 이러한 메서드는 셀 시퀀싱 깊이 탈락에 의해 복잡 하 게 RNA 시퀀싱 기술의 출현 이론적으로 셀의 전체 transcriptome 측정 하는 가능성을 제공 합니다. 단일 셀 정량 제공 중요 한 유전자에 있는 모든 세포의 수백의 식의 과민 하 고 강력한 분석 기술 노이즈 감소 마찬가지로 처리 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 의료 연구, 스웨덴어 유년기 암 재단, 라 그 나 Söderberg 재단, 그리고는 크누트와 앨리스 발 렌 버그 재단에 대 한 스웨덴의 암 사회, 스웨덴 연구 위원회, 스웨덴의 사회에서 교부 금에 의해 지원
Materials
| CD14 PECY5 | eBioscience | 15-0149-42 | Clone: 61D3 |
| CD16 PECY5 | Biolegend | 302010 | Clone: 3G8 |
| CD56 PECY5 | Biolegend | 304608 | Clone: MEM-188 |
| CD19 PECY5 | Biolegend | 302210 | Clone: HIB19 |
| CD2 PECY5 | Biolegend | 300210 | Clone: RPA-2.10 |
| CD3 PECY5 | Biolegend | 300310 | Clone: HIT3a |
| CD123 PECY5 | Biolegend | 306008 | Clone: 6H6 |
| CD235A PECY5 | BD Pharma | 559944 | Clone GAR2 |
| CD34 FITC | Biolegend | 343604 | Clone: 561 |
| CD38 APC | Biolegend | 303510 | Clone: Hit2 |
| CD90 PE | Biolegend | 328110 | Clone: 5E10 |
| CD45RA BV421 | BD bioscience | 560362 | Clone: HI100 |
| CD49f Pecy7 | eBioscience | 25-0495-82 | Clone: eBioGOH3 |
| FBS | HyClone | SV30160.3 | |
| PBS | HyClone | SH30028.02 | |
| 96-well u-bottom Plate | VWR | 10861-564 | |
| SFEM | Stem cell technologies | 9650 | |
| Penicillin streptomycin | HyClone | SV30010 | |
| TPO | Peprotech | 300-18 | |
| SCF | Peprotech | 300-07 | |
| FLT3L | Peprotech | 300-19 | |
| Falcon Tube 15 mL | Sarstedt | 62.554.502 | |
| Eppendorph tube | Sarstedt | 72.690.001 | |
| CST beads | BD | 642412 | |
| Accudrop Beads | BD | 345249 | 6-µm particles |
| Adhesive film Clear | Thermo scientific | AB-1170 | |
| Adhesive film Foil | Thermo scientific | AB-0626 | |
| 96 well PCR plate | Axygen | PCR-96M2-HS-C | |
| PCR 1.5 mL tube | Axygen | MCT-150-L-C | |
| T100 PCR cycler | BioRad | 186-1096 | |
| 10% NP40 | Thermo scientific | 85124 | |
| 10mM dNTP | Takara | 4030 | |
| 0.1M DTT | Invitrogen | P2325 | |
| RNAsout | Invitrogen | 10777-019 | RNAse inhibitor |
| CellsDirect One-Step qRT-PCR Kit | Invitrogen | 11753-100 | |
| Neuclease free water | Invitrogen | 11753-100 | from CellsDirect kit |
| 2X Reaction Mix | Invitrogen | 11753-100 | from CellsDirect kit |
| SuperScript III RT/Platinum Taq Mix | Invitrogen | 11753-100 | from CellsDirect kit |
| Platinum Taq DNA Polymerase | Invitrogen | 10966026 | |
| TaqMan Cells-to-CT Control Kit | Invitrogen | 4386995 | |
| Xeno RNA Control | Invitrogen | 4386995 | From TaqMan Cells-to-CT Control Kit |
| 20X Xeno RNA Control Taqman Gene Expression Assay | Invitrogen | 4386995 | From TaqMan Cells-to-CT Control Kit |
| 96.96 Sample/Loading Kit—10 IFCs | Fluidigm | BMK-M10-96.96 | |
| 2X Assay Loading Reagent | Fluidigm | From 96.96 Sample/Loading Kit | |
| 20X GE Sample Loading Reagent | Fluidigm | From 96.96 Sample/Loading Kit | |
| Control line fluid | Fluidigm | From 96.96 Sample/Loading Kit | |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | Applied Biosystems | 4369016 | |
| BioMark HD | Fluidigm | BMKHD-BMKHD | |
| 96.96 Dynamic Array IFC | Fluidigm | BMK-M10-96.96GT | |
| Excel | Microsoft | Microsoft | |
| FlowJo V10 | TreeStar | TreeStar | |
| Fluidigm real time PCR analysis | Fluidigm | Fluidigm | |
| CD179a.VPREB1 | Thermofisher scientific | Hs00356766_g1 | |
| ACE | Thermofisher scientific | Hs00174179_m1 | |
| AHR | Thermofisher scientific | Hs00169233_m1 | |
| BCR_ABL.52 | Thermofisher scientific | Hs03043652_ft | |
| BCR_ABL41 | Thermofisher scientific | Hs03024541_ft | |
| BMI1 | Thermofisher scientific | Hs00995536_m1 | |
| CCNA2 | Thermofisher scientific | Hs00996788_m1 | |
| CCNB1 | Thermofisher scientific | Hs01030099_m1 | |
| CCNB2 | Thermofisher scientific | Hs01084593_g1 | |
| CCNC | Thermofisher scientific | Hs01029304_m1 | |
| CCNE1 | Thermofisher scientific | Hs01026535_g1 | |
| CCNF | Thermofisher scientific | Hs00171049_m1 | |
| CCR9 | Thermofisher scientific | Hs01890924_s1 | |
| CD10.MME | Thermofisher scientific | Hs00153510_m1 | |
| CD11a | Thermofisher scientific | Hs00158218_m1 | |
| CD11c.ITAX | Thermofisher scientific | Hs00174217_m1 | |
| CD123.IL3RA | Thermofisher scientific | Hs00608141_m1 | |
| CD133.PROM1 | Thermofisher scientific | Hs01009250_m1 | |
| CD151 | Thermofisher scientific | Hs00911635_g1 | |
| CD220.INSR | Thermofisher scientific | Hs00961554_m1 | |
| CD24.HSA | Thermofisher scientific | Hs03044178_g1 | |
| NCOR1 | Thermofisher scientific | Hs01094540_m1 | |
| CD26.DPP4 | Thermofisher scientific | Hs00175210_m1 | |
| CD274 | Thermofisher scientific | Hs01125301_m1 | |
| CD276 | Thermofisher scientific | Hs00987207_m1 | |
| CD32.FCGR2B | Thermofisher scientific | Hs01634996_s1 | |
| CD33 | Thermofisher scientific | Hs01076281_m1 | |
| CD34 | Thermofisher scientific | Hs00990732_m1 | |
| CD344.FZD4 | Thermofisher scientific | Hs00201853_m1 | |
| CD352.SLAMF6 | Thermofisher scientific | Hs01559920_m1 | |
| CD38 | Thermofisher scientific | Hs01120071_m1 | |
| CD4 | Thermofisher scientific | Hs01058407_m1 | |
| CD41.ITGA2B | Thermofisher scientific | Hs01116228_m1 | |
| CD49f.ITGA6 | Thermofisher scientific | Hs01041011_m1 | |
| CD56.NCAM1 | Thermofisher scientific | Hs00941830_m1 | |
| CD9 | Thermofisher scientific | Hs00233521_m1 | |
| CD97 | Thermofisher scientific | Hs00173542_m1 | |
| CD99 | Thermofisher scientific | Hs00908458_m1 | |
| CDK6 | Thermofisher scientific | Hs01026371_m1 | |
| CDKN1A | Thermofisher scientific | Hs00355782_m1 | |
| CDKN1B | Thermofisher scientific | Hs01597588_m1 | |
| CDKN1C | Thermofisher scientific | Hs00175938_m1 | |
| CEBPa | Thermofisher scientific | Hs00269972_s1 | |
| CSF1r | Thermofisher scientific | Hs00911250_m1 | |
| CSF2RA | Thermofisher scientific | Hs00531296_g1 | |
| CSF3RA | Thermofisher scientific | Hs01114427_m1 | |
| E2A.TCF3 | Thermofisher scientific | Hs00413032_m1 | |
| EBF1 | Thermofisher scientific | Hs01092694_m1 | |
| ENG | Thermofisher scientific | Hs00923996_m1 | |
| EPOR | Thermofisher scientific | Hs00959427_m1 | |
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| FLI1 | Thermofisher scientific | Hs00956711_m1 | |
| FLT3 | Thermofisher scientific | Hs00174690_m1 | |
| FOXO1 | Thermofisher scientific | Hs01054576_m1 | |
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| GATA1 | Thermofisher scientific | Hs00231112_m1 | |
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| GATA3 | Thermofisher scientific | Hs00231122_m1 | |
| GFI1 | Thermofisher scientific | Hs00382207_m1 | |
| HES1 | Thermofisher scientific | Hs01118947_g1 | |
| HLF | Thermofisher scientific | Hs00171406_m1 | |
| HMGA2 | Thermofisher scientific | Hs00171569_m1 | |
| HOXA5 | Thermofisher scientific | Hs00430330_m1 | |
| HOXB4 | Thermofisher scientific | Hs00256884_m1 | |
| ID2 | Thermofisher scientific | Hs04187239_m1 | |
| IGF2BP1 | Thermofisher scientific | Hs00198023_m1 | |
| IGF2BP2 | Thermofisher scientific | Hs01118009_m1 | |
| IKZF1 | Thermofisher scientific | Hs00172991_m1 | |
| IL1RAP | Thermofisher scientific | Hs00895050_m1 | |
| IL2RG | Thermofisher scientific | Hs00953624_m1 | |
| IRF8 | Thermofisher scientific | Hs00175238_m1 | |
| ITGB7 | Thermofisher scientific | Hs01565750_m1 | |
| KIT | Thermofisher scientific | Hs00174029_m1 | |
| Lin28B | Thermofisher scientific | Hs01013729_m1 | |
| LMO2 | Thermofisher scientific | Hs00153473_m1 | |
| LYL1 | Thermofisher scientific | Hs01089802_g1 | |
| Meis1 | Thermofisher scientific | Hs01017441_m1 | |
| mKi67 | Thermofisher scientific | Hs01032443_m1 | |
| MPL | Thermofisher scientific | Hs00180489_m1 | |
| MPO | Thermofisher scientific | Hs00924296_m1 | |
| NFIB | Thermofisher scientific | Hs01029175_m1 | |
| Notch1 | Thermofisher scientific | Hs01062011_m1 | |
| Pten | Thermofisher scientific | Hs02621230_s1 | |
| RAG2 | Thermofisher scientific | Hs01851142_s1 | |
| RPS18 | Thermofisher scientific | Hs01375212_g1 | |
| RUNX1 | Thermofisher scientific | Hs00231079_m1 | |
| Shisa2 | Thermofisher scientific | Hs01590823_m1 | |
| Spi1 | Thermofisher scientific | Hs02786711_m1 | |
| Sterile.IgH | Thermofisher scientific | Hs00378435_m1 | |
| TAL1 | Thermofisher scientific | Hs01097987_m1 | |
| THY1 | Thermofisher scientific | Hs00264235_s1 | |
| Tim.3.HAVCR2 | Thermofisher scientific | Hs00958618_m1 | |
| VWF | Thermofisher scientific | Hs00169795_m1 |
References
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