En kombinasjon encellede tilnærming som karakteriserer den molekylære og Immunophenotypic heterogenitet menneskelige stammen og stamfar bestander
Summary
Bulk genet uttrykk målinger Sky enkeltcelle forskjeller i ulike celle populasjoner. Her beskriver vi en protokoll for hvordan encellede gene expression analyse og indeks sortering av Florescence aktivert celle sortering (FACS) kan kombineres for å avgrense heterogenitet og immunophenotypically karakterisere molecularly ulike celle populasjoner.
Abstract
Immunophenotypic karakterisering og molekylære analyse har lenge vært brukt til å avgrense heterogenitet og definere ulike celle populasjoner. FACS er iboende en enkeltcelle analysen, men før molekylær analyse, målcellene er ofte prospektivt isolert i bulk, og dermed miste encellede oppløsning. Encellede genet uttrykk analysen gir et middel til å forstå molekylær forskjellene mellom enkeltceller i ulike celle populasjoner. I bulk celle analyse resulterer en overrepresentation av en distinkt celle type i skjevheter og occlusions av signaler fra sjeldne celler med biologisk betydning. Ved å benytte FACS indeks sortering sammen til én celle gene expression analyse, befolkninger kan undersøkes uten tap av encellede oppløsning mens celler med middels cellen overflaten markør uttrykk er også tatt, slik at evaluering av relevansen av kontinuerlig overflaten markør uttrykk. Her beskriver vi en tilnærming som kombinerer encellede omvendt transkripsjon kvantitative PCR (RT-qPCR) og FACS indeks sortering samtidig betegner den molekylære og immunophenotypic heterogenitet i celle populasjoner.
I motsetning til én celle RNA sekvensering metoder tillater bruk av qPCR med spesifikt mål forsterkning for robust målinger av lav-overflod utskrifter med færre utfall, mens det ikke er forvirret av spørsmål knyttet til celle til celle variasjoner i Les dybde. Videre innrømmer av direkte indeks-sortering single-celler til lysis bufre denne metoden, for cDNA syntese og bestemt mål før forsterkning utføres i ett trinn så vel som for korrelasjon av senere avledede molekylær signaturer med celleoverflaten markør uttrykk. Beskrevet tilnærming er blitt bebygget å undersøke blodkreft single-celler, men har også blitt brukt med hell på andre celletyper.
Avslutningsvis gir tilnærming beskrevet her sensitive måling av mRNA uttrykk for et panel for forhåndsvalgt gener med mulighet for påfølgende potensielle isolering av molecularly distinkte subpopulasjoner å utvikle.
Introduction
Hver blod celle antas å ligge i en mobilnettet hierarki, der stamceller danne toppen på en rekke stadig forpliktet mellomliggende progenitors som til slutt terminalt skiller ut de endelige effektor cellene med bestemte biologiske funksjoner1. Mye av kunnskap om hvordan stamcelleforskningen systemer er organisert er generert i blodkreft systemet, hovedsakelig på grunn av muligheten til å isolere prospektivt distinkte blodkreft bestander høyanriket stamceller eller ulike progenitors2 av FACS sortering. Dette har tillatt for mange av disse befolkningene som skal analyseres funksjonelt eller molecularly, hovedsakelig gjennom gene expression profilering3,4. Men når analysere genuttrykk av bulk bestander individuelle forskjeller mellom celler er gjennomsnitt og tapte5. Således, manglende evne til å oppdage celle til celle variasjoner i heterogene celle fraksjoner kan forvirre vår forståelse av viktige biologiske prosesser hvis små undergrupper av celler konto for tiltenkt biologiske funksjonen til at befolkningen6, 7. Derimot undersøkelse av genuttrykk signaturer encellede oppløsning tilbyr en mulighet til å avgrense heterogenitet og omgå altoverskyggende påvirkninger fra overrepresentert delsett av celler8.
Hittil har blitt utviklet mange protokoller for enkeltceller gene expression analyse; med begge fremgangsmåtene har sine egne begrensninger. Den første metoden var RNA fluorescerende i situ hybridisering (RNA-fisk), som måler et begrenset antall utskrifter for en tid, men er unik ved at den tillater undersøkelse av RNA lokalisering9,11. Tidlige metoder bruker PCR og qPCR for å oppdage en enkelt eller svært få transkripsjoner ble også utviklet12. Men har disse i det siste blitt erstattet av microfluidics-baserte metoder som kan samtidig analysere uttrykk for hundrevis av transkripsjoner per celle i hundrevis av celler gjennom qPCR og dermed kunne høy-dimensjonale heterogenitet analyse bruke forhåndsbestemt genet panel10,13. Nylig RNA sekvensering-baserte teknologier har blitt mye brukt for enkelt celle analyse, dette teoretisk kan måle det hele transcriptome av en celle og dermed legge en utforskende dimensjon til heterogenitet analyse10, 14. Multiplexed qPCR analyse og encellede RNA sekvensering har ulike funksjoner, derfor begrunnelsen for å bruke en av metodene er avhengig av spørsmålet spurte samt antall celler i målgruppen. Høy gjennomstrømming og lav kostnad per celle med objektiv, utforskende kjennetegner encellede RNA sekvensering er ønskelig når ukjent celle eller store populasjoner er undersøkt. Imidlertid er encellede RNA sekvensering også forutinntatt mot sekvensering høy rikelig transkripsjoner oftere mens utskrifter med lav overflod er utsatt for brudd. Dette kan føre til betydelig komplekse data som setter høye krav på bioinformatic analyse å avsløre viktig molekylær signaler som er ofte subtile eller skjult i teknisk støy15. Dermed for godt karakterisert vev, encellede qPCR analyse bruker forhåndsbestemt primer paneler valgt for funksjonelt viktig gener eller molekylære markører kan tjene som en sensitiv, enkel tilnærming til å bestemme heterogenitet av en befolkningen. Men det bør bemerkes at i forhold til én celle RNA-seq, kostnaden per celle er generelt høyere for én celle qPCR metoder. Her beskriver vi en tilnærming som kombinerer encellede RT-qPCR (endret fra Teles J. et al. 16), FACS indeksen sortering17 og bioinformatikk analyse-18 for å samtidig karakterisere den molekylære og immunophenotypic heterogenitet i populasjoner.
I denne cellen befolkningen av interesse er farget og enkelt-celler er sortert etter FACS direkte i lyseringsbuffer i 96-brønnen PCR plater. Samtidig registreres uttrykk nivåene av et ekstra sett med celle-overflate markører for hver eneste celle under FACS-sortering, en metode som kalles indeks-sortering. Lysed celle materialet forsterkes senere og gene uttrykk for et utvalgt sett av gener analysert med RT-qPCR, bruk en microfluidic plattform. Denne strategien kan molekylær analyse av sorterte encellede samt samtidige karakterisering av hver enkelt celle celle-overflate markør uttrykk. Ved å direkte tilordne molecularly forskjellige undergrupper av celler til uttrykk for den indekserte sorterte markører, kan subpopulasjoner være knyttet til en bestemt immunophenotype som kan brukes for deres potensielle isolasjon. Metoden er beskrevet trinn for trinn i figur 1. Et forhåndsbestemt genet panel ytterligere bidrar til en høyere oppløsning av de målrettede genuttrykk, siden det omgår måling av irrelevante rikelig gener som kan ellers occlude subtile gene expression signaler. Videre gir det spesifikt mål forsterkning, ett trinn omvendt transkripsjon og forsterkning robust måling av lav uttrykt transkripsjoner, som transkripsjonsfaktorer eller ikke-poly-adenylated RNAs. Viktigst, kan qPCR metoder for måling av mRNA fra fusion proteiner, noe som er viktig i undersøker visse maligne sykdommer19. Til slutt fokuserte antall gener undersøkt, lav skolegangen, og begrenset tekniske forskjellene mellom celler gjør denne metoden lett analysert i forhold til høyere-dimensjonale metoder, for eksempel encellede RNA-seq. Ved å følge protokollen, kan et hele eksperiment utføres, sortering celler til analysert resultatene, innen tre dager, noe som gjør dette til en ukomplisert og rask metode for følsom, høy gjennomstrømming encellede gene expression analyse.
Protocol
Representative Results
Discussion
De siste årene, har encellede gene expression analyse blitt et verdifullt tillegg til å definere heterogenitet ulike celle populasjoner23. Ankomsten av RNA sekvensering teknologi gir teoretisk mulighet til å måle det hele transcriptome av en celle, men disse metodene er komplisert ved celle til celle sekvensering dypet og Signalbortfall. Encellede qPCR tilbyr en følsom og robust analyse av uttrykk for hundrevis av kritiske gener der alle cellene behandles på samme måte å redusere tekniske …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet er støttet av tilskudd fra svenske Cancer Society, den svenske Research Council, The Swedish Society for medisinsk forskning, den svenske Childhood Cancer Foundation, The Ragnar Söderberg Foundation, og The Knut og Alice Wallenberg Foundation
Materials
| CD14 PECY5 | eBioscience | 15-0149-42 | Clone: 61D3 |
| CD16 PECY5 | Biolegend | 302010 | Clone: 3G8 |
| CD56 PECY5 | Biolegend | 304608 | Clone: MEM-188 |
| CD19 PECY5 | Biolegend | 302210 | Clone: HIB19 |
| CD2 PECY5 | Biolegend | 300210 | Clone: RPA-2.10 |
| CD3 PECY5 | Biolegend | 300310 | Clone: HIT3a |
| CD123 PECY5 | Biolegend | 306008 | Clone: 6H6 |
| CD235A PECY5 | BD Pharma | 559944 | Clone GAR2 |
| CD34 FITC | Biolegend | 343604 | Clone: 561 |
| CD38 APC | Biolegend | 303510 | Clone: Hit2 |
| CD90 PE | Biolegend | 328110 | Clone: 5E10 |
| CD45RA BV421 | BD bioscience | 560362 | Clone: HI100 |
| CD49f Pecy7 | eBioscience | 25-0495-82 | Clone: eBioGOH3 |
| FBS | HyClone | SV30160.3 | |
| PBS | HyClone | SH30028.02 | |
| 96-well u-bottom Plate | VWR | 10861-564 | |
| SFEM | Stem cell technologies | 9650 | |
| Penicillin streptomycin | HyClone | SV30010 | |
| TPO | Peprotech | 300-18 | |
| SCF | Peprotech | 300-07 | |
| FLT3L | Peprotech | 300-19 | |
| Falcon Tube 15 mL | Sarstedt | 62.554.502 | |
| Eppendorph tube | Sarstedt | 72.690.001 | |
| CST beads | BD | 642412 | |
| Accudrop Beads | BD | 345249 | 6-µm particles |
| Adhesive film Clear | Thermo scientific | AB-1170 | |
| Adhesive film Foil | Thermo scientific | AB-0626 | |
| 96 well PCR plate | Axygen | PCR-96M2-HS-C | |
| PCR 1.5 mL tube | Axygen | MCT-150-L-C | |
| T100 PCR cycler | BioRad | 186-1096 | |
| 10% NP40 | Thermo scientific | 85124 | |
| 10mM dNTP | Takara | 4030 | |
| 0.1M DTT | Invitrogen | P2325 | |
| RNAsout | Invitrogen | 10777-019 | RNAse inhibitor |
| CellsDirect One-Step qRT-PCR Kit | Invitrogen | 11753-100 | |
| Neuclease free water | Invitrogen | 11753-100 | from CellsDirect kit |
| 2X Reaction Mix | Invitrogen | 11753-100 | from CellsDirect kit |
| SuperScript III RT/Platinum Taq Mix | Invitrogen | 11753-100 | from CellsDirect kit |
| Platinum Taq DNA Polymerase | Invitrogen | 10966026 | |
| TaqMan Cells-to-CT Control Kit | Invitrogen | 4386995 | |
| Xeno RNA Control | Invitrogen | 4386995 | From TaqMan Cells-to-CT Control Kit |
| 20X Xeno RNA Control Taqman Gene Expression Assay | Invitrogen | 4386995 | From TaqMan Cells-to-CT Control Kit |
| 96.96 Sample/Loading Kit—10 IFCs | Fluidigm | BMK-M10-96.96 | |
| 2X Assay Loading Reagent | Fluidigm | From 96.96 Sample/Loading Kit | |
| 20X GE Sample Loading Reagent | Fluidigm | From 96.96 Sample/Loading Kit | |
| Control line fluid | Fluidigm | From 96.96 Sample/Loading Kit | |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | Applied Biosystems | 4369016 | |
| BioMark HD | Fluidigm | BMKHD-BMKHD | |
| 96.96 Dynamic Array IFC | Fluidigm | BMK-M10-96.96GT | |
| Excel | Microsoft | Microsoft | |
| FlowJo V10 | TreeStar | TreeStar | |
| Fluidigm real time PCR analysis | Fluidigm | Fluidigm | |
| CD179a.VPREB1 | Thermofisher scientific | Hs00356766_g1 | |
| ACE | Thermofisher scientific | Hs00174179_m1 | |
| AHR | Thermofisher scientific | Hs00169233_m1 | |
| BCR_ABL.52 | Thermofisher scientific | Hs03043652_ft | |
| BCR_ABL41 | Thermofisher scientific | Hs03024541_ft | |
| BMI1 | Thermofisher scientific | Hs00995536_m1 | |
| CCNA2 | Thermofisher scientific | Hs00996788_m1 | |
| CCNB1 | Thermofisher scientific | Hs01030099_m1 | |
| CCNB2 | Thermofisher scientific | Hs01084593_g1 | |
| CCNC | Thermofisher scientific | Hs01029304_m1 | |
| CCNE1 | Thermofisher scientific | Hs01026535_g1 | |
| CCNF | Thermofisher scientific | Hs00171049_m1 | |
| CCR9 | Thermofisher scientific | Hs01890924_s1 | |
| CD10.MME | Thermofisher scientific | Hs00153510_m1 | |
| CD11a | Thermofisher scientific | Hs00158218_m1 | |
| CD11c.ITAX | Thermofisher scientific | Hs00174217_m1 | |
| CD123.IL3RA | Thermofisher scientific | Hs00608141_m1 | |
| CD133.PROM1 | Thermofisher scientific | Hs01009250_m1 | |
| CD151 | Thermofisher scientific | Hs00911635_g1 | |
| CD220.INSR | Thermofisher scientific | Hs00961554_m1 | |
| CD24.HSA | Thermofisher scientific | Hs03044178_g1 | |
| NCOR1 | Thermofisher scientific | Hs01094540_m1 | |
| CD26.DPP4 | Thermofisher scientific | Hs00175210_m1 | |
| CD274 | Thermofisher scientific | Hs01125301_m1 | |
| CD276 | Thermofisher scientific | Hs00987207_m1 | |
| CD32.FCGR2B | Thermofisher scientific | Hs01634996_s1 | |
| CD33 | Thermofisher scientific | Hs01076281_m1 | |
| CD34 | Thermofisher scientific | Hs00990732_m1 | |
| CD344.FZD4 | Thermofisher scientific | Hs00201853_m1 | |
| CD352.SLAMF6 | Thermofisher scientific | Hs01559920_m1 | |
| CD38 | Thermofisher scientific | Hs01120071_m1 | |
| CD4 | Thermofisher scientific | Hs01058407_m1 | |
| CD41.ITGA2B | Thermofisher scientific | Hs01116228_m1 | |
| CD49f.ITGA6 | Thermofisher scientific | Hs01041011_m1 | |
| CD56.NCAM1 | Thermofisher scientific | Hs00941830_m1 | |
| CD9 | Thermofisher scientific | Hs00233521_m1 | |
| CD97 | Thermofisher scientific | Hs00173542_m1 | |
| CD99 | Thermofisher scientific | Hs00908458_m1 | |
| CDK6 | Thermofisher scientific | Hs01026371_m1 | |
| CDKN1A | Thermofisher scientific | Hs00355782_m1 | |
| CDKN1B | Thermofisher scientific | Hs01597588_m1 | |
| CDKN1C | Thermofisher scientific | Hs00175938_m1 | |
| CEBPa | Thermofisher scientific | Hs00269972_s1 | |
| CSF1r | Thermofisher scientific | Hs00911250_m1 | |
| CSF2RA | Thermofisher scientific | Hs00531296_g1 | |
| CSF3RA | Thermofisher scientific | Hs01114427_m1 | |
| E2A.TCF3 | Thermofisher scientific | Hs00413032_m1 | |
| EBF1 | Thermofisher scientific | Hs01092694_m1 | |
| ENG | Thermofisher scientific | Hs00923996_m1 | |
| EPOR | Thermofisher scientific | Hs00959427_m1 | |
| ERG | Thermofisher scientific | Hs01554629_m1 | |
| FLI1 | Thermofisher scientific | Hs00956711_m1 | |
| FLT3 | Thermofisher scientific | Hs00174690_m1 | |
| FOXO1 | Thermofisher scientific | Hs01054576_m1 | |
| GAPDH | Thermofisher scientific | Hs02758991_g1 | |
| GATA1 | Thermofisher scientific | Hs00231112_m1 | |
| GATA2 | Thermofisher scientific | Hs00231119_m1 | |
| GATA3 | Thermofisher scientific | Hs00231122_m1 | |
| GFI1 | Thermofisher scientific | Hs00382207_m1 | |
| HES1 | Thermofisher scientific | Hs01118947_g1 | |
| HLF | Thermofisher scientific | Hs00171406_m1 | |
| HMGA2 | Thermofisher scientific | Hs00171569_m1 | |
| HOXA5 | Thermofisher scientific | Hs00430330_m1 | |
| HOXB4 | Thermofisher scientific | Hs00256884_m1 | |
| ID2 | Thermofisher scientific | Hs04187239_m1 | |
| IGF2BP1 | Thermofisher scientific | Hs00198023_m1 | |
| IGF2BP2 | Thermofisher scientific | Hs01118009_m1 | |
| IKZF1 | Thermofisher scientific | Hs00172991_m1 | |
| IL1RAP | Thermofisher scientific | Hs00895050_m1 | |
| IL2RG | Thermofisher scientific | Hs00953624_m1 | |
| IRF8 | Thermofisher scientific | Hs00175238_m1 | |
| ITGB7 | Thermofisher scientific | Hs01565750_m1 | |
| KIT | Thermofisher scientific | Hs00174029_m1 | |
| Lin28B | Thermofisher scientific | Hs01013729_m1 | |
| LMO2 | Thermofisher scientific | Hs00153473_m1 | |
| LYL1 | Thermofisher scientific | Hs01089802_g1 | |
| Meis1 | Thermofisher scientific | Hs01017441_m1 | |
| mKi67 | Thermofisher scientific | Hs01032443_m1 | |
| MPL | Thermofisher scientific | Hs00180489_m1 | |
| MPO | Thermofisher scientific | Hs00924296_m1 | |
| NFIB | Thermofisher scientific | Hs01029175_m1 | |
| Notch1 | Thermofisher scientific | Hs01062011_m1 | |
| Pten | Thermofisher scientific | Hs02621230_s1 | |
| RAG2 | Thermofisher scientific | Hs01851142_s1 | |
| RPS18 | Thermofisher scientific | Hs01375212_g1 | |
| RUNX1 | Thermofisher scientific | Hs00231079_m1 | |
| Shisa2 | Thermofisher scientific | Hs01590823_m1 | |
| Spi1 | Thermofisher scientific | Hs02786711_m1 | |
| Sterile.IgH | Thermofisher scientific | Hs00378435_m1 | |
| TAL1 | Thermofisher scientific | Hs01097987_m1 | |
| THY1 | Thermofisher scientific | Hs00264235_s1 | |
| Tim.3.HAVCR2 | Thermofisher scientific | Hs00958618_m1 | |
| VWF | Thermofisher scientific | Hs00169795_m1 |
References
- Seita, J., Weissman, I. L. Hematopoietic stem cell: Self-renewal versus differentiation. Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 2 (6), 640-653 (2010).
- Orkin, S. H., Zon, L. I. Hematopoiesis: An evolving paradigm for stem cell biology. Cell. 132 (4), 631-644 (2008).
- Ye, F., Huang, W., Guo, G. Studying hematopoiesis using single-cell technologies. Journal of Hematology & Oncology. 10, 27 (2017).
- Hoppe, P. S., Coutu, D. L., Schroeder, T. Single-cell technologies sharpen up mammalian stem cell research. Nature Cell Biology. 16 (10), 919-927 (2014).
- Wills, Q. F., et al. Single-cell gene expression analysis reveals genetic associations masked in whole-tissue experiments. Nature Biotechnol. 31 (8), 748-752 (2013).
- Velten, L., et al. Human haematopoietic stem cell lineage commitment is a continuous process. Nat Cell Biol. 19 (4), 271-281 (2017).
- Wilson, N. K., Nicola, K., et al. Combined single-cell functional and gene expression analysis resolves heterogeneity within stem cell populations. Cell Stem Cell. 16 (6), 712-724 (2015).
- Saliba, A. E., Westermann, A. J., Gorski, S. A., Vogel, J. Single-cell RNA-seq: Advances and future challenges. Nucleic Acids Research. 42 (14), 8845-8860 (2014).
- Femino, A. M., Fay, F. S., Fogarty, K., Singer, R. H. Visualization of Single RNA Transcripts in Situ. Science. 280 (5363), 585-590 (1998).
- Kalisky, T., et al. A brief review of single-cell transcriptomic technologies. Briefings in Functional Genomics. , elx019 (2017).
- Crosetto, N., Bienko, M., van Oudenaarden, A. Spatially resolved transcriptomics and beyond. Nature Reviews Genetics. 16, 57 (2014).
- Bengtsson, M., Ståhlberg, A., Rorsman, P., Kubista, M. Gene expression profiling in single cells from the pancreatic islets of Langerhans reveals lognormal distribution of mRNA levels. Genome Research. 15 (10), 1388-1392 (2005).
- Bengtsson, M., Hemberg, M., Rorsman, P., Ståhlberg, A. Quantification of mRNA in single cells and modelling of RT-qPCR induced noise. BMC Molecular Biology. 9 (1), 63 (2008).
- Picelli, S., et al. Smart-seq2 for sensitive full-length transcriptome profiling in single cells. Nature Methods. 10, 1096 (2013).
- Tung, P. -. Y., et al. Batch effects and the effective design of single-cell gene expression studies. Scientific Reports. 7, 39921 (2017).
- Teles, J., Enver, T., Pina, C. Single-cell PCR profiling of gene expression in hematopoiesis. Methods in Molecular Biology. , 21-42 (2014).
- Hayashi, T., et al. Single-cell gene profiling of planarian stem cells using fluorescent activated cell sorting and its "index sorting" function for stem cell research. Development, Growth, & Differentiation. 52 (1), 131-144 (2010).
- Lang, S., et al. SCExV: A webtool for the analysis and visualisation of single cell qRT-PCR data. BMC Bioinformatics. 16 (1), 320 (2015).
- de Klein, A., et al. A cellular oncogene is translocated to the Philadelphia chromosome in chronic myelocytic leukaemia. Nature. 300 (5894), 765-767 (1982).
- . indexed-sorting Available from: https://github.com/FlowJo-LLC/indexed-sorting (2016)
- Warfvinge, R., et al. Single-cell molecular analysis defines therapy response and immunophenotype of stem cell subpopulations in CML. Blood. 129 (17), 2384-2394 (2017).
- Nestorowa, S., et al. A single-cell resolution map of mouse hematopoietic stem and progenitor cell differentiation. Blood. 128 (8), e20-e31 (2016).
- Breton, G., et al. Human dendritic cells (DCs) are derived from distinct circulating precursors that are precommitted to become CD1c+ or CD141+ DCs. The Journal of Experimental Medicine. 213 (13), 2861-2870 (2016).
- Alberti-Servera, L., et al. Single-cell RNA sequencing reveals developmental heterogeneity among early lymphoid progenitors. The EMBO Journal. 36 (24), 3619-3633 (2017).
- Giustacchini, A., et al. Single-cell transcriptomics uncovers distinct molecular signatures of stem cells in chronic myeloid leukemia. Nature Medicine. 23, 692 (2017).
- Hansmann, L., Han, A., Penter, L., Liedtke, M., Davis, M. M. Clonal expansion and interrelatedness of distinct B-lineage compartments in multiple myeloma bone marrow. Cancer Immunology Research. 5 (9), 744-754 (2017).
- Psaila, B., et al. Single-cell profiling of human megakaryocyte-erythroid progenitors identifies distinct megakaryocyte and erythroid differentiation pathways. Genome Biology. 17 (1), 83 (2016).
- Schulte, R., et al. Index sorting resolves heterogeneous murine hematopoietic stem cell populations. Experimental Hematology. 43 (9), 803-811 (2015).
