Voorbereiding van Drosophila larvale monsters van gaschromatografie-massaspectrometrie (GC-MS)-gebaseerd metabolomica
Summary
Dit protocol wordt beschreven hoe voor te bereiden Drosophila larven op basis van GC-MS metabolomic analyse.
Abstract
Recente ontwikkelingen op het gebied van metabolomica hebben de fruitvlieg Drosophila melanogaster opgericht als een krachtige genetisch model voor het bestuderen van dierlijke metabolisme. Door het combineren van de enorme serie van Drosophila genetische hulpmiddelen met de mogelijkheid om grote zwaden van intermediaire metabolisme enquête, kan een aanpak metabolomica complexe interacties tussen voeding, genotype, levensgeschiedenis evenementen en milieu signalen onthullen. Bovendien, kunnen metabolomica studies ontdekken nieuwe enzymatische mechanismen en voorheen onbekende verbindingen tussen schijnbaar ongelijksoortige stofwisselingsroutes ontdekken. Teneinde meer wijdverbreide gebruik van deze technologie onder de Drosophila Gemeenschap, hier voorzien wij een gedetailleerd protocol waarin wordt beschreven hoe voor te bereiden Drosophila larvale monsters gaschromatografie-massaspectrometrie (GC-MS)- op basis van metabolomic analyse. Onze protocol bevat beschrijvingen van larvale sample collectie, metaboliet extractie, chemische bewerking en GC-MS-analyse. Succesvolle afronding van dit protocol kunnen gebruikers voor het meten van de relatieve overvloed van kleine polar metabolieten, waaronder suikers, aminozuren en organische zuren die betrokken zijn in de glycolyse en de fietsen van het TCA.
Introduction
De fruitvlieg Drosophila melanogaster heeft ontpopt als een ideaal systeem voor het bestuderen van het moleculaire mechanisme dat tussenliggende metabolisme reguleren. Niet alleen zijn de meeste stofwisselingsroutes bewaard tussen Drosophila en de mens, maar ook belangrijke nutriënten sensoren en groeiregulatoren, zoals insuline, Tor en myc, zijn actief in de vliegen1,2. Dientengevolge, kan Drosophila worden gebruikt om te verkennen de metabole basis van ziekten bij de mens variërend van diabetes en obesitas tot neurodegeneratie en kanker. In dit verband biedt Drosophila larvale ontwikkeling het ideale kader om te bestuderen van een metabole programma genoemd aërobe glycolyse, of het Warburg effect. Net zoals veel tumoren aërobe glycolyse gebruiken biomassa genereren uit koolhydraten, dus activeren hiervoor Drosophila larven aërobe glycolyse ter bevordering van de ontwikkelingstoxiciteit groei3,4,5. Deze overeenkomsten tussen larvale en tumor metabolisme Drosophila vast te stellen als een belangrijke model om te begrijpen hoe aërobe glycolyse is gereglementeerde in vivo.
Ondanks het feit dat de vlieg heeft ontpopt als een populair model voor het bestuderen van de stofwisseling, vertrouwen meeste Drosophila studies op methoden die zijn ontworpen voor het meten van individuele metabolieten3, zoals trehalose, triglyceriden of ATP. Aangezien een specifiek protocol vereist is voor het meten van elk metaboliet, zijn assay gebaseerde studies arbeidsintensief, duur en bevooroordeeld naar deze verbindingen die kunnen worden gemeten met behulp van commerciële kits. Een oplossing voor deze beperkingen is gebleken uit het veld van metabolomica, waarmee een meer efficiënte en onpartijdige middel van het bestuderen van Drosophila metabolisme. In tegenstelling tot een kwantitatieve analyse gebaseerde studie, kan een analyse van één metabolomic tegelijk meten van honderden kleine molecuul metabolieten en bieden een grondig inzicht in een organisme van metabole status6,7. Deze techniek heeft het toepassingsgebied van Drosophila metabole studies aanzienlijk uitgebreid en vertegenwoordigt de toekomst van deze opkomende veld8.
Metabolomic onderzoeken worden hoofdzakelijk uitgevoerd met behulp van drie technologieën: (i) nucleaire magnetische resonantie (NMR), (ii) de vloeibare chromatografie-massaspectrometrie (LC-MS), en (iii) verlenging van het gaschromatografie-massaspectrometrie (GC-MS)9. Elke benadering biedt verschillende voordelen en nadelen, en alle van deze technologieën zijn gebruikt om succesvol studeren Drosophila metabolisme. Aangezien het onderzoek uitgevoerd in ons lab is gericht op kleine, polar metabolieten, we gebruiken voornamelijk een op basis van GC-MS methode. GC-MS biedt de gebruiker met een aantal voordelen, waaronder hoge reproduceerbaarheid, de resolutie van de piek, de gevoeligheid, en de beschikbaarheid van een standaard elektron effect (EI) spectrale bibliotheek, die het mogelijk voor de snelle identificatie van maakt metabole ontdekt functies10,11. De bereiding van de monsters voor de GC-MS, echter, is enigszins complex en vereist een zorgvuldige aandacht voor detail. Monsters worden verzameld, gewassen, gewogen, en bevroren op een wijze die snel metabole reacties lest. Bovendien, het vliegen karkas is resistent tegen standaard homogenisering protocollen en vereist een kraal molen om optimale metaboliet extractie. Tot slot moeten monsters geanalyseerd door GC-MS chemische bewerking vóór detectie12ondergaan. Terwijl eerder gepubliceerde methoden elk van deze stappen3,13,14 beschrijven, is nog steeds een visuele protocol dat zou de beginnende gebruiker reproducibly het genereren van hoge kwaliteit gegevens nodig. Hier laten we zien hoe Drosophila larvale monsters om voor te bereiden op basis van GC-MS metabolomica analyse. Dit protocol kan de gebruiker reproducibly veel van de kleine polar metabolieten, waaruit de centrale koolstof metabolisme te meten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Metabolomica biedt een ongeëvenaarde mogelijkheid om enquête de metabole reacties waaruit intermediaire metabolisme. De gevoeligheid van deze technologie, maakt gegevens echter gevoelig voor genetische achtergrond, developmental signalen, en een scala aan milieu benadrukt, met inbegrip van de temperatuur, de vochtigheid, de bevolkingsdichtheid en de beschikbaarheid van nutriënten. Dus, een hoge kwaliteit en reproduceerbare metabolomica analyse vereist dat de monsters worden genomen in sterk gecontroleerde omstandighed…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dankzij de leden van de Indiana University Massa Spectroscopy faciliteit en de Universiteit van Utah metabolomica Core faciliteit voor hulp bij het optimaliseren van dit protocol. J.M.T. wordt ondersteund door de National Institute of General Medical Sciences van de National Institutes of Health onder Award nummer R35GM119557.
Materials
| Unsulfured blackstrap molasses | Good Food, INC | ||
| Drosophila Agar Type II | Genesee Scientific | 66-103 | |
| Pyridine | EMD Millipore | PX2012-7 | |
| Methoxyamine hydrocholoride (MOX) | MP Biomedicals, LLC | 155405 | |
| MSTFA with 1% trimethylchlorosilane | Sigma | 69478 | |
| Fleischmann’s Active dry yeast | AB Mauri Food Inc | 2192 | |
| 6oz Drosophila stock bottle | Genesee Scientific | 32-130 | |
| Soft tissue homogenizing mix (2 mL tubes) | Omni International | SKU:19-627 | |
| Vial insert, 250 µL deactivated glass with polymer feet | Agilent | 5181-8872 | |
| Succinic acid-2,2,3,3-d4 | Sigma | 293075 | |
| SpeedVac | Thermo | SC210A | |
| o-Phosphoric acid | Fisher Scientific | A242-1 | |
| Propionic acid | Sigma | P5561 | |
| p-Hydroxy benzoic acid methyl ester | Genesee Scientific | 20-258 | |
| Bead Ruptor | Omni International | SKU:19-040E | |
| ThermoMixer F1.5 | Eppendorf | 5384000012 | |
| MultiTherm Shaker with a 24 X 12 mm block | Benchmark Scientific | H5000 | |
| Methanol | Sigma | 34860 | |
| 1.5 mL centrifuge tube | Eppendorf | 22364111 | |
| Falcon 35 X 10 mm tissue culture dish | Corning Incorporated | 353001 | |
| GC column | Phenomex | ZB-5MSi |
References
- Owusu-Ansah, E., Perrimon, N. Modeling metabolic homeostasis and nutrient sensing in Drosophila: implications for aging and metabolic diseases. Disease Models & Mechanisms. 7 (3), 343-350 (2014).
- Sieber, M. H., Spradling, A. C. The role of metabolic states in development and disease. Current Opinion in Genetics & Development. 45, 58-68 (2017).
- Tennessen, J. M., Barry, W. E., Cox, J., Thummel, C. S. Methods for studying metabolism in Drosophila. Methods. 68 (1), 105-115 (2014).
- Li, H., et al. Drosophila larvae synthesize the putative oncometabolite L-2-hydroxyglutarate during normal developmental growth. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (6), 1353-1358 (2017).
- Tennessen, J. M., Baker, K. D., Lam, G., Evans, J., Thummel, C. S. The Drosophila Estrogen-Related Receptor Directs a Metabolic Switch that Supports Developmental Growth. Cell Metabolism. 13 (2), 139-148 (2011).
- Nicholson, J. K., Lindon, J. C., Holmes, E. Metabonomics’: understanding the metabolic responses of living systems to pathophysiological stimuli via multivariate statistical analysis of biological NMR spectroscopic data. Xenobiotica. 29 (11), 1181-1189 (1999).
- Fiehn, O. Metabolomics – the link between genotypes and phenotypes. Plant Molecular Biology. 48 (1-2), 155-171 (2002).
- Cox, J. E., Thummel, C. S., Tennessen, J. M. Metabolomic Studies in Drosophila. Genetics. 206 (3), 1169-1185 (2017).
- Lenz, E. M., Wilson, I. D. Analytical strategies in metabonomics. Journal of Proteome Research. 6 (2), 443-458 (2007).
- Pasikanti, K. K., Ho, P. C., Chan, E. C. Y. Gas chromatography/mass spectrometry in metabolic profiling of biological fluids. Journal of Chromatography B-Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 871 (2), 202-211 (2008).
- Want, E. J., Nordstrom, A., Morita, H., Siuzdak, G. From exogenous to endogenous: The inevitable imprint of mass spectrometry in metabolomics. Journal of Proteome Research. 6 (2), 459-468 (2007).
- Garcia, A., Barbas, C., Metz, T. O. . Metabolic Profiling: Methods and Protocols Vol. 708 Methods in Molecular Biology. , 191-204 (2011).
- Chan, E. C. Y., Pasikanti, K. K., Nicholson, J. K. Global urinary metabolic profiling procedures using gas chromatography-mass spectrometry. Nature Protocols. 6 (10), 1483-1499 (2011).
- Dunn, W. B., et al. Procedures for large-scale metabolic profiling of serum and plasma using gas chromatography and liquid chromatography coupled to mass spectrometry. Nature Protocols. 6 (7), 1060-1083 (2011).
- Ashburner, M. . Drosophila: A Laboratory Manual. , 171-178 (1989).
- Biyasheva, A., Do, T. V., Lu, Y., Vaskova, M., Andres, A. J. Glue secretion in the Drosophila salivary gland: a model for steroid-regulated exocytosis. Developmental Biology. 231 (1), 234-251 (2001).
- Lommen, A. MetAlign: Interface-driven, versatile metabolomics tool for hyphenated full-scan mass spectrometry data preprocessing. Analytical Chemistry. 81 (8), 3079-3086 (2009).
- Xia, J., Wishart, D. S. Using MetaboAnalyst 3.0 for comprehensive metabolomics data analysis. Current Protocols in Bioinformatics. 55, (2016).
- Xia, J., Sinelnikov, I. V., Han, B., Wishart, D. S. MetaboAnalyst 3.0-making metabolomics more meaningful. Nucleic Acids Research. 43 (W1), W251-W257 (2015).
- Lommen, A. Data (pre-)processing of nominal and accurate mass LC-MS or GC-MS data using MetAlign. Methods in Molecular Biology. 860, 229-253 (2012).
- Xia, J., Wishart, D. S. Using MetaboAnalyst 3.0 for comprehensive metabolomics data analysis. Current Protocols in Bioinformatics. 55, (2016).
- Xia, J., Wishart, D. S. Web-based inference of biological patterns, functions and pathways from metabolomic data using MetaboAnalyst. Nature Protocols. 6 (6), 743-760 (2011).
- Li, H., Tennessen, J. M. Methods for studying the metabolic basis of Drosophila development. Wiley Interdisciplinary Reviews Developmental Biology. 6 (5), (2017).
