가스 크로마토그래피-질량 분석 (GC-MS) 초파리 애벌레 샘플의 준비-대사체학을 기반으로

요약

이 프로토콜 GC-MS 기반 metabolomic 분석 초파리 애벌레를 준비 하는 방법을 설명 합니다.

초록

Metabolomics의 분야의 최근 발전 동물 물질 대사 공부에 대 한 강력한 유전자 모델 초파리 melanogaster 과일 파리를 설립 했다. 결합 하 여 초파리 유전자 도구의 광대 한 배열을 조사 중간 대사의 큰 swaths 하는 기능, 대사체학 접근 다이어트, 유전자 형, 생활 역사 사건과 환경 신호 사이 복잡 한 상호 작용을 밝힐 수 있다. 또한, 대사체학 연구 소설 효소 기계 장치를 발견 하 고 겉보기에 서로 다른 대사 경로 사이 이전에 알려지지 않은 연결을 밝히기 수 있습니다. 초파리 지역 사회 중이 기술을 더 광범위 한 사용을 촉진 하기 위하여 여기 우리 가스 크로마토그래피-질량 분석 (GC-MS)에 대 한 초파리 애벌레 샘플을 준비 하는 방법을 설명 하는 상세한 프로토콜 제공- metabolomic 분석을 기반 으로합니다. 우리의 프로토콜 애벌레 샘플 수집, 대사 산물 추출, 화학 derivatization 및 GC-MS 분석에 대 한 설명을 포함합니다. 이 프로토콜의 성공적인 완료는 분해와 TCA 주기에서 아미노산, 당 분, 유기 산 관련된을 포함 하 여 작은 극 지 대사 산물의 관계 되는 풍부를 측정 하는 사용자 수 있게 됩니다.

서론

과일 파리 초파리 melanogaster 중간 신진 대사를 조절 하는 분자 메커니즘을 공부 하는 이상적인 시스템으로 떠오르고 있다. 대부분 대사 경로 보존 초파리 와 인간 사이 뿐만 아니라 주요 영양소 센서 및 성장 레 귤 레이 터, 인슐린, 토르, myc, 등 비행^1,2활성도 있습니다. 그 결과, 초파리 는 당뇨병과 비만에서 neurodegeneration, 암에 이르기까지 인간의 질병의 변화 기초를 탐구 하 사용할 수 있습니다. 이와 관련, 초파리 애벌레 개발 호 기성 분해, 또는 바르 부르 크 효과로 알려진 신진 대사 프로그램을 공부 하는 이상적인 프레임 워크를 제공 합니다. 마찬가지로 많은 종양 호 기성 분해를 사용 하 여 탄수화물에서 바이오 매스를 생성, 그래서 할 초파리 애벌레 활성화 촉진 발달 성장^3,,45호 기성 분해. 애벌레 사이의 이러한 유사성 및 종양 물질 대사 이해 어떻게 에어로빅에 대 한 주요 모델 초파리

프로토콜

1. 달걀 컬렉션

1. 성인 남성 및 원하는 genotypes의 처녀 여성을 수집 합니다. 개별적으로 3-5 일에 대 한 표준 블루밍턴 미디어와 식품 유리병에서이 동물을 나이.
2. 새로운 음식 유리병에 50 처녀 암컷과 25 남성을 전송 하 여 적절 한 matings를 설정 합니다.
   참고: 최소 6 개의 독립적인 matings 설정 되어야 합니다 각 유전자 형에 대 한. 하나의 샘플 각 짝짓기 (즉, 6 개의 독립적인 matings에서 수집 된는 6 샘플)에서 수집 됩니다.
3. 당 밀 계란-누워 모자를 준비 합니다.
   1. 115 mL 당 밀의과 한 천의 29 g H₂O 2 L 플라스 크에 700 mL와 함께 믹스.
   2. 당 밀 뜨거운 접시에 한 천 혼합물을 끓인 다.
   3. 70 ° c에 냉각
   4. 산 믹스 (20 mL의 85% 인산 H₂O; 1 L에 209 mL 프로 산 25 mL를 추가 갈색 병에 게)와 95% 에탄올에 10% p hydroxy benzoic 산 메 틸 에스테 르의 10 mL.
   5. 35 x 10 m m² 조직 배양 접시의 뚜껑과 하단 부분에 당 밀 한 천 하 거 라.<....

결과

젖 산 효소 dLDH 활동⁴, 그리고 유전자 일치 컨트롤 부족 (dLDH) 뮤턴트 중순 L2 애벌레로 수집 되었고 위에서 설명한 프로토콜에 따라 처리. 컨트롤과 비교 될 때 돌연변이 애벌레 젖 산, pyruvate, 및 L-2-hydroxyglutarate⁴에 상당한 변화를 전시 한다. 스펙트럼은 애질런트 GC6890 5973i MS 시스템으로 인수 했다. GC-MS 스펙트럼의 예로 생성 우리의 프로토콜 그림 1에 표시 됩니다. 많은 기능을 볼 수 있으며 일반적으로 애벌레 샘플의 가장 큰 피크를 나타냅니다 하 고 일반적으로, 트 레 할 로스에 대 한 주목할 만한 피크 oversaturated (그림 1AB). 부정적인 컨트롤 샘플의 개.......

토론

대사체학 중간 대사를 구성 하는 대사 반응을 조사 하는 최상의 기회를 제공 한다. 그러나이 기술의 감도 데이터 유전 배경, 발달 단서와 다양 한 환경 스트레스, 온도, 습도, 인구 밀도, 그리고 양분 가용성을 포함 하 여 렌더링 합니다. 따라서, 높은 품질과 재현성 대사체학 분석이 매우 제어 조건 하에서 샘플을 수집 하는 것. 여러 리뷰가 포인트^3,,823강조, 여기 우리가 재현성을 보장 하도록 설계 된 애벌레를 수집에 대 한 단계별 방법을 제공 합니다.

대사체학 분석에 가변성의 가장 일반적인 소스는 끄다, 또는 중지, 샘플 수집 후 신진 대사 반응 하는 실패에서 유래한 다. 이와 관련, 액체 질소에서 동결 시 대사는 정지 하 고 샘플은-20 ° C 메탄올에 무 균 때 대사 효소를 파괴 될 것 이다. 사용자 샘플 .......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
무황 블랙스트랩 당밀	Good Food, INC
Drosophila Agar Type II	Genesee Scientific	66-103
피리딘	EMD Millipore	PX2012-7
메톡시아민 하이드로콜로라이드(MOX)	MP Biomedicals, LLC	155405
MSTFA with 1% 트리메틸클로로실란	Sigma	69478
플라이슈만 s 활성 건조 효모	AB Mauri Food Inc	2192
6oz 초파리 주식 병	Genesee Scientific	32-130
연조직 균질화 믹스 (2 mL 튜브)	Omni International	SKU:19-627
바이알 인서트, 250 &마이크로; L 폴리머 피트가 있는 비활성화 유리	Agilent	5181-8872
숙신산-2,2,3,3-d4	Sigma	293075
SpeedVac	Thermo	SC210A
o-인산	Fisher Scientific	A242-1
프로피온산	Sigma	P5561
p-하이드록시 벤조산 메틸 에스테르	Genesee Scientific	20-258
비드 Ruptor	Omni International	SKU:19-040E
ThermoMixer F1.5	Eppendorf	5384000012
24 X 12 mm 블록이 있는 MultiTherm Shaker	Benchmark Scientific	H5000
메탄올	Sigma	34860
1.5 mL 원심분리기 튜브	Eppendorf	22364111
Falcon 35 X 10 mm 조직 배양 접시	Corning Incorporated	353001
GC 컬럼	Phenomex	ZB-5MSi