가스 크로마토그래피-질량 분석 (GC-MS) 초파리 애벌레 샘플의 준비-대사체학을 기반으로
Summary
이 프로토콜 GC-MS 기반 metabolomic 분석 초파리 애벌레를 준비 하는 방법을 설명 합니다.
Abstract
Metabolomics의 분야의 최근 발전 동물 물질 대사 공부에 대 한 강력한 유전자 모델 초파리 melanogaster 과일 파리를 설립 했다. 결합 하 여 초파리 유전자 도구의 광대 한 배열을 조사 중간 대사의 큰 swaths 하는 기능, 대사체학 접근 다이어트, 유전자 형, 생활 역사 사건과 환경 신호 사이 복잡 한 상호 작용을 밝힐 수 있다. 또한, 대사체학 연구 소설 효소 기계 장치를 발견 하 고 겉보기에 서로 다른 대사 경로 사이 이전에 알려지지 않은 연결을 밝히기 수 있습니다. 초파리 지역 사회 중이 기술을 더 광범위 한 사용을 촉진 하기 위하여 여기 우리 가스 크로마토그래피-질량 분석 (GC-MS)에 대 한 초파리 애벌레 샘플을 준비 하는 방법을 설명 하는 상세한 프로토콜 제공- metabolomic 분석을 기반 으로합니다. 우리의 프로토콜 애벌레 샘플 수집, 대사 산물 추출, 화학 derivatization 및 GC-MS 분석에 대 한 설명을 포함합니다. 이 프로토콜의 성공적인 완료는 분해와 TCA 주기에서 아미노산, 당 분, 유기 산 관련된을 포함 하 여 작은 극 지 대사 산물의 관계 되는 풍부를 측정 하는 사용자 수 있게 됩니다.
Introduction
과일 파리 초파리 melanogaster 중간 신진 대사를 조절 하는 분자 메커니즘을 공부 하는 이상적인 시스템으로 떠오르고 있다. 대부분 대사 경로 보존 초파리 와 인간 사이 뿐만 아니라 주요 영양소 센서 및 성장 레 귤 레이 터, 인슐린, 토르, myc, 등 비행1,2활성도 있습니다. 그 결과, 초파리 는 당뇨병과 비만에서 neurodegeneration, 암에 이르기까지 인간의 질병의 변화 기초를 탐구 하 사용할 수 있습니다. 이와 관련, 초파리 애벌레 개발 호 기성 분해, 또는 바르 부르 크 효과로 알려진 신진 대사 프로그램을 공부 하는 이상적인 프레임 워크를 제공 합니다. 마찬가지로 많은 종양 호 기성 분해를 사용 하 여 탄수화물에서 바이오 매스를 생성, 그래서 할 초파리 애벌레 활성화 촉진 발달 성장3,,45호 기성 분해. 애벌레 사이의 이러한 유사성 및 종양 물질 대사 이해 어떻게 에어로빅에 대 한 주요 모델 초파리 를 설치 분해는 레 귤 레이트 된 vivo에서.
즉석 대사 공부에 대 한 인기 모델로 떠오르고 있다 사실에도 불구 하 고 대부분 초파리 연구는 개별 대사 산물3, 트 레 할 로스, 트리 글리세라이드, ATP 등을 측정 하도록 설계 된 방법에 의존. 특정 프로토콜 각 대사 산물을 측정 하는 데 필요한, 이후 분석 결과 기초를 둔 학문은 노동 집약, 비싸고, 그 화합물 상업 키트를 사용 하 여 측정할 수 있는 쪽으로 편 파. 이러한 제한 사항에 대 한 해결책의 대사체학, 초파리 대사 공부 보다 효율적이 고 공평한 방법을 제공 분야에서 나왔다. 분석 결과 기반 연구와 달리 단일 metabolomic 분석 수 있습니다 동시에 작은 분자 대사 산물의 수백을 측정 하 고 유기 체의 대사 상태6,7에 대 한 포괄적인 이해를 제공. 이 기술은 크게 초파리 대사 연구의 범위를 확장 했다 그리고이 신흥 분야8의 미래를 나타냅니다.
Metabolomic 연구는 주로 세 가지 기술을 사용 하 여 실시: (i) 핵 자기 공명 (NMR), (ii) 액체 크로마토그래피-질량 분석 (MS LC), 및 (iii) 가스 크로마토그래피-질량 분석 (GC-MS)9. 각 접근 제공 뚜렷한 장점과 단점, 그리고 이러한 모든 기술은 성공적으로 초파리 대사 공부 하 사용 되었습니다. 때문에 실험실에서 실시 하는 연구, 극 지 대사 산물에 초점을 맞추고, 우리가 주로 GC-MS 기반 메서드를 사용 합니다. GC-MS 장점, 높은 재현성, 최대 해상도, 감도, 등의 번호와 사용자를 제공 하 고의 급속 한 식별 수 있는 표준 전자 영향 (EI) 스펙트럼 라이브러리의 가용성 변화 발견 기능10,11. 그러나 GC-ms, 샘플의 준비, 다소 복잡 하 고 세부 사항에 주의 요구 한다. 샘플 수집, 세척, 몸 무게, 고 대사 반응을 신속 하 게 냉각 하는 방식으로 냉동 있습니다. 또한, 비행 시체는 표준 균질 프로토콜에 저항 하며 최적의 대사 산물 추출 되도록 비드 밀. 마지막으로, GC-MS 분석 샘플 탐지12이전 화학 derivatization를 겪어야 한다. 이전에 게시 방법이 단계3,,1314의 모든 설명, 동안 reproducibly 고품질 데이터를 생성 하는 초보자 사용자 있도록 시각적 프로토콜 여전히 필요 합니다. 여기 GC-MS 기반 대사체학 분석 초파리 애벌레 샘플을 준비 하는 방법을 보여 줍니다. 이 프로토콜 reproducibly 측정 하는 중앙 탄소 물질 대사를 구성 하는 작은 극 지 대사 산물의 많은 사용자를 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
대사체학 중간 대사를 구성 하는 대사 반응을 조사 하는 최상의 기회를 제공 한다. 그러나이 기술의 감도 데이터 유전 배경, 발달 단서와 다양 한 환경 스트레스, 온도, 습도, 인구 밀도, 그리고 양분 가용성을 포함 하 여 렌더링 합니다. 따라서, 높은 품질과 재현성 대사체학 분석이 매우 제어 조건 하에서 샘플을 수집 하는 것. 여러 리뷰가 포인트3,,8…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
인디애나 대학 질량 분광학 시설 및 대학의 유타 대사체학 핵심 시설 지원이이 프로토콜 최적화에 대 한 회원 들에 게 감사. J.M.T.에 의해 국립 연구소의 일반 의료 과학 수상 번호 R35GM119557에서 국립 보건원의 지원 됩니다.
Materials
| Unsulfured blackstrap molasses | Good Food, INC | ||
| Drosophila Agar Type II | Genesee Scientific | 66-103 | |
| Pyridine | EMD Millipore | PX2012-7 | |
| Methoxyamine hydrocholoride (MOX) | MP Biomedicals, LLC | 155405 | |
| MSTFA with 1% trimethylchlorosilane | Sigma | 69478 | |
| Fleischmann’s Active dry yeast | AB Mauri Food Inc | 2192 | |
| 6oz Drosophila stock bottle | Genesee Scientific | 32-130 | |
| Soft tissue homogenizing mix (2 mL tubes) | Omni International | SKU:19-627 | |
| Vial insert, 250 µL deactivated glass with polymer feet | Agilent | 5181-8872 | |
| Succinic acid-2,2,3,3-d4 | Sigma | 293075 | |
| SpeedVac | Thermo | SC210A | |
| o-Phosphoric acid | Fisher Scientific | A242-1 | |
| Propionic acid | Sigma | P5561 | |
| p-Hydroxy benzoic acid methyl ester | Genesee Scientific | 20-258 | |
| Bead Ruptor | Omni International | SKU:19-040E | |
| ThermoMixer F1.5 | Eppendorf | 5384000012 | |
| MultiTherm Shaker with a 24 X 12 mm block | Benchmark Scientific | H5000 | |
| Methanol | Sigma | 34860 | |
| 1.5 mL centrifuge tube | Eppendorf | 22364111 | |
| Falcon 35 X 10 mm tissue culture dish | Corning Incorporated | 353001 | |
| GC column | Phenomex | ZB-5MSi |
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