يعيش خلية تصوير TGF-β/Smad3 مما يشير إلى المسار في المختبر و في فيفو باستخدام نظام مراسل إتش
Summary
نقدم هنا، بروتوكولا لتصوير الخلية الحية TGF-β/Smad3 مما يشير إلى النشاط باستخدام نظام مراسل إتش. هذا النظام تعقب النشاط الترانسكربتي في الوقت الحقيقي، ويمكن تطبيقها على كل واحدة من الخلايا في المختبر وفي الحيوانات الحيةالنماذج.
Abstract
تحويل عامل النمو مما يشير إلى بيتا (TGF-β) ينظم العديد من الوظائف الهامة المطلوبة للتوازن الخلوية ويوجد عادة overexpressed في العديد من الأمراض، بما في ذلك السرطان. TGF-β بشدة تورط في ورم خبيث خلال أواخر مرحلة تطور السرطان، تفعيل مجموعة فرعية خلايا السرطانية الكثيرة الارتحال والغازية. الأساليب الحالية للإشارات تحليل مسار التركيز على نماذج نقطة النهاية، والتي غالباً ما تحاول قياس الإشارات وظيفة مخصصة للحدث البيولوجي ولا تعكس الطابع التدريجي لهذا المرض. هنا، علينا أن نظهر إتش رواية مراسل نظام محدد للمسار TGF-β/Smad3 إرسال الإشارات التي يمكن الكشف عن التنشيط النسخي في الخلايا الحية. استخدام مراسل الإعلانية-كاجا12-Td-توم ، يمكننا أن نحقق معدل إصابة بنسبة 100% من جمعية نجمة داود الحمراء-ميغابايت-231 الخلايا ضمن 24 ساعة في المختبر. يسمح استخدام مراسل الفلورسنت لتصوير خلايا حية في الوقت الحقيقي مع التعرف المباشر من الخلايا النشطة ترانسكريبتيونالي. تنشيط الخلايا المصابة مع TGF-β يعرض مجموعة فرعية فقط من الخلايا التي يتم ترانسكريبتيونالي النشط والمشاركة في الوظائف البيولوجية المحددة. يسمح هذا النهج بخصوصية عالية وحساسية على مستوى خلية واحدة تعزيز فهم الوظائف البيولوجية المتصلة ب TGF-β الإشارات في المختبر. Smad3 يمكن أيضا أن يكون النشاط الترانسكربتي عنها في فيفو في الوقت الحقيقي من خلال التطبيق الإعلانية-كاجا12-لوك المراسل. الإعلانية-كاجا12-لوك يمكن أن يقاس بنفس الطريقة كخطوط الخلايا لوسيفراس ستابلي transfected التقليدية. يمكن تحليلها من خلال تصوير إيفيس التقليدية Smad3 النسخي نشاط الخلايا مزروع في فيفو ورصدها لايف أثناء تطور الورم، تقديم رؤية فريدة من نوعها في ديناميات مسار الإشارات TGF-β. لدينا بروتوكول وصف نظام تسليم مراسل مفيد السماح للتصوير الفائق السريع للخلايا الحية مما يشير إلى مسارات في المختبر و في فيفوعلى حد سواء. ويمكن توسيع هذا الأسلوب على مجموعة من الصور على أساس فحوصات ويعرض كنهج حساسة واستنساخه للبيولوجيا الأساسية والتنمية العلاجية.
Introduction
تحويل عامل النمو بيتا (TGF-β) هو سيتوكين أساسي المتورطين في التنمية البشرية أن الإشارات عبر هيتيروديميريك معقدة تتألف من النوع الثاني، والنوع الأول من مستقبلات1. ملزم بكتابة مستقبلات الثاني النتائج في التوظيف والفسفره من نوع أنا مستقبلات، الذي بدوره فوسفوريلاتيس المصب Smad2/3 البروتينات2،3. تنشيط هذه Smad2/3 ربط البروتينات Smad4، تشكيل مجمع translocates إلى النواة، وينظم الجينات النسخ4. تحت شروط التماثل الساكن TGF-β/سمد مما يشير إلى أحكام تنظم؛ ومع ذلك، في العديد من الأمراض، مسار الإشارات هو رفع الضوابط التنظيمية و overexpressed غالباً ما تؤدي إلى تطور المرض5،،من67. أظهرت الدراسات الأخيرة أن الاستجابة الخلوية إلى TGF-β ايربان والفئات السكانية الفرعية TGF-β/سمد الخلايا النشطة المسؤولة عن الوظيفة البيولوجية ب طريقة تعتمد على الوقت8،9. تحليل الخلوية المشتركة مما يشير إلى TGF-β/سمد ينطوي على استخدام نقطة نهاية ثابتة فحوصات أن توفر سوى لقطة نشاط الخلوي وغالباً ما قوانتيتاتي TGF-β/سمد تأثير متوسط10. هذه الأساليب، ومع ذلك، قد لا بدقة تمثل تصرفات الجزيئية TGF-β/سمد إشارات في حالة فسيولوجية أثناء تطور المرض. التقاط الصورة القائمة على تحليل الخلايا الحية ديناميات العمليات الخلوية والبيولوجية مع فهم المكانية والزمانية.
أن هدفنا التوصل إلى أسلوب الفائق حساسية لتصوير الخلايا الحية من TGF-β/سمد مما يشير إلى استخدام الكواشف المستندة إلى إتش. هنا، نحن المصابين خط خلية سرطان الثدي البشرية MDA-ميغابايت-231 إتش التعبير عن تسلسل ربط الحافز كاجا Smad3 ولوسيفراس (لوك) أو الجينات مراسل Td-الطماطم (Td-توم). توفر أنظمة مراسل أدينوفيرال طريقة رخيصة وسريعة لإدخال بلازميد التي يمكن أن يسفر عن معدل إصابة بنسبة 100% في خطوط خلايا السرطان. نظم مراسل أدينوفيرال كما طبقت بنجاح إلى خطوط الخلايا التي يصعب على ترانسفيكت مع بلازميد التقليدية11. في هذا البروتوكول ونحن سوف تصف عملية استنساخه وموسع لتحقيق تصوير الخلايا الحية لمسار TGFβ/سمد الإشارات في الجسم الحي وفي المختبر.
Protocol
Representative Results
Discussion
قمنا بتطوير تقنية للسماح للتصوير في الوقت الحقيقي من إشارات TGF-β/Smad3 في الخلايا الحية المفردة. باستخدام هذا الأسلوب الرواية، سابقا حددنا عدد سكان الفرعية للخلايا مع دينامية النشاط النسخي TGF-β/Smad3 الذي ارتبط بغزو المحسنة والهجرة8. يحسن هذا الأسلوب على الاختبارات التقليدية للإشا…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل منح مقدمة من “الوطنية للصحة” ومجلس البحوث الطبية (NHMRC) لبعض ح. تمبو مستلم “جائزة أستراليا العليا” من “الحكومة الأسترالية” و “أن هندرسون منحة دراسية” أعلى حتى من “الأسترالية الروتاري الصحة” في شريك مع منظمة الروتاري تيمبليستووي وتناول العشاء لعلاج.
Materials
| DMEM | ThermoFisher | 1881024 | Warm in 37 °C waterbath before use |
| Foetal Bovine Serum | Scientifix Life | FBS500-S | Heat inactivated before use |
| Recombinant Human TGF-β1 | PEPROTECH | 100-21 | Aliquot in DDW to make final concentration at 10 mg/mL |
| Hoechst-33258 | Tocris Bioscience | 5117 | Dilute in to PBS to make final concentration at 1 μL/mL |
| Luciferase Reporter Assay Kit | Promega | 197897 | Dilute 5x in PBS before use |
| Luminometer | Promega | 9100-002 | |
| Phase contrast fluorescence microscopy | OLYMPUS | IX50 | |
| Centrifuge | eppendorf | 5810 R | |
| VivoGl Luciferin | Promega | P1041 | |
| IVIS Lumina III In Vivo Imaging System | PerkinElmer | CLS136334 | |
| 0.5% Trypsin-EDTA (10x) | ThermoFisher | 15400-054 | Diltue to 0.05% (1x) in PBS |
| Cell Culture Lysis 5x Reagent | Promega | E153A | Dilute to 1x in DDW |
| 10% Formalin | Sigma-Aldrich | F5554-4L | |
| HEK 293A | ThermoFisher | R70507 | |
| MDA-MB-231 | ATCC | CRM-HTB-26 | |
| PRKDC-SCID | Animal Resources Centre | SCIDF6 | |
| Matrigel | Corning | 354234 | |
| Isoflurane | Zoetis | 26675-46-7 | |
| Ethanol | Chem-supply | EA043-10L-P | |
| Refresh Night Time | Allergan | 1750D | Lubricating Eye Ointment |
| Solution | Composition | ||
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | NaH2PO4.2H2O (4 mM); NaHPO4 (16 mM); NaCl (0.12M) | ||
| FBS-DMEM | 5% heat inactivated FBS; 10 μg/mL penicillin; 100 μg/mL streptomycin |
References
- Massague, J., Like, B. Cellular receptors for type beta transforming growth factor. Ligand binding and affinity labeling in human and rodent cell lines. The Journal of biological chemistry. 260, 2636-2645 (1985).
- Xu, L., Chen, Y. G., Massague, J. The nuclear import function of Smad2 is masked by SARA and unmasked by TGFbeta-dependent phosphorylation. Nature Cell Biology. 2, 559-562 (2000).
- Massague, J. TGFbeta signaling in context. Nature reviews. Molecular cell biology. 13, 616-630 (2012).
- Massague, J., Seoane, J., Wotton, D. Smad transcription factors. Genes Development. 19, 2783-2810 (2005).
- Blobe, G. C., Schiemann, W. P., Lodish, H. F. Role of transforming growth factor beta in human disease. The New England journal of medicine. , 1350-1358 (2000).
- Zhu, H. J., Burgess, A. W. Regulation of transforming growth factor-beta signaling. Molecular cell biology research communications : MCBRC. 4, 321-330 (2001).
- Massagué, J. TGFβ in Cancer. Cell. 134, 215-230 (2008).
- Luwor, R. B., et al. Single live cell TGF-beta signaling imaging: breast cancer cell motility and migration is driven by sub-populations of cells with dynamic TGF-beta-Smad3 activity. Molecular cancer. 14, 50 (2015).
- Clarke, D. C., Liu, X. Decoding the quantitative nature of TGF-beta/Smad signaling. Trends in Cell Biol.ogy. 18, 430-442 (2008).
- Zhao, R., Li, N., Xu, J., Li, W., Fang, X. Quantitative single-molecule study of TGF-beta/Smad signaling. Acta Biochimica et Biophysica Sinica (Shanghai). 50, 51-59 (2017).
- Luwor, R. B., et al. New reagents for improved in vitro and in vivo examination of TGF-beta signalling. Growth factors. 29, 211-218 (2011).
- Dennler, S., et al. Direct binding of Smad3 and Smad4 to critical TGF beta-inducible elements in the promoter of human plasminogen activator inhibitor-type 1 gene. EMBO J. 17, 3091-3100 (1998).
- Luwor, R. B., et al. Targeting Stat3 and Smad7 to restore TGF-beta cytostatic regulation of tumor cells in vitro and in vivo. Oncogene. 32, 2433-2441 (2013).
- Reed, L. J., Muench, H. A Simple Method of Estimating Fifty Per Cent Endpoints. American Journal of Epidemiology. 27, 493-497 (1938).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature methods. 9, 671-675 (2012).
- Dennler, S., Prunier, C., Ferrand, N., Gauthier, J. M., Atfi, A. c-Jun inhibits transforming growth factor beta-mediated transcription by repressing Smad3 transcriptional activity. The Journal of biological chemistry. 275, 28858-28865 (2000).
- Fink, S. P., Mikkola, D., Willson, J. K., Markowitz, S. TGF-beta-induced nuclear localization of Smad2 and Smad3 in Smad4 null cancer cell lines. Oncogene. 22, 1317-1323 (2003).
- Zinn, K. R., et al. Noninvasive bioluminescence imaging in small animals. ILAR J. 49, 103-115 (2008).
- Kim, T. K., Eberwine, J. H. Mammalian cell transfection: the present and the future. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397, 3173-3178 (2010).
- Russell, W. C. Update on adenovirus and its vectors. Journal of General Virology. 81, 2573-2604 (2000).
- Lee, C. S., et al. Adenovirus-Mediated Gene Delivery: Potential Applications for Gene and Cell-Based Therapies in the New Era of Personalized Medicine. Genes & Diseases. 4, 43-63 (2017).
- Wang, I. I., Huang, I. I. Adenovirus technology for gene manipulation and functional studies. Drug Discovery Today. 5, 10-16 (2000).
- Kochanek, S., et al. A new adenoviral vector: Replacement of all viral coding sequences with 28 kb of DNA independently expressing both full-length dystrophin and beta-galactosidase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93, 5731-5736 (1996).
- Wang, Q., Finer, M. H. Second-generation adenovirus vectors. Nature Medicine. 2, 714-716 (1996).
- Durham, H. D., et al. Toxicity of replication-defective adenoviral recombinants in dissociated cultures of nervous tissue. Experimental Neurology. 140, 14-20 (1996).
- MacKenzie, K. L., Hackett, N. R., Crystal, R. G., Moore, M. A. Adenoviral vector-mediated gene transfer to primitive human hematopoietic progenitor cells: assessment of transduction and toxicity in long-term culture. Blood. 96, 100-108 (2000).
- Zhang, W. W., Koch, P. E., Roth, J. A. Detection of wild-type contamination in a recombinant adenoviral preparation by PCR. Biotechniques. 18, 444-447 (1995).
- Choi, Y., Chang, J. Viral vectors for vaccine applications. Clinical and Experimental Vaccine Research. 2, 97-105 (2013).
- de Cassan, S. C., et al. The requirement for potent adjuvants to enhance the immunogenicity and protective efficacy of protein vaccines can be overcome by prior immunization with a recombinant adenovirus. Journal of immunology. 187, 2602-2616 (2011).
- Krasnykh, V. N., Mikheeva, G. V., Douglas, J. T., Curiel, D. T. Generation of recombinant adenovirus vectors with modified fibers for altering viral tropism. Journal of Virology. 70, 6839-6846 (1996).
- Wickham, T. J., et al. Increased in vitro and in vivo gene transfer by adenovirus vectors containing chimeric fiber proteins. Journal of Virology. 71, 8221-8229 (1997).
- Smith, F., Jacoby, D., Breakefield, X. O. Virus vectors for gene delivery to the nervous system. Restorative neurology and neuroscience. 8, 21-34 (1995).
- Zhou, F., et al. Nuclear receptor NR4A1 promotes breast cancer invasion and metastasis by activating TGF-beta signalling. Nature communications. 5, 3388 (2014).
