Viver a imagem latente da pilha do TGF-β/Smad3 sinalização Pathway In Vitro e In Vivo usando um sistema de repórter de adenovírus
Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para a imagem latente de célula viva de TGF-β/Smad3 sinalização atividade usando um sistema de repórter de adenovírus. Este sistema controla a atividade transcricional em tempo real e pode ser aplicado para as duas células únicas em vitro e em animais vivosmodelos.
Abstract
Transformar o fator de crescimento β (TGF-β) sinalização regula muitas funções importantes, necessárias para a homeostase celular e é comumente encontrada overexpressed em muitas doenças, incluindo câncer. TGF-β está fortemente implicada na metástase durante a progressão de câncer estágio atrasado, ativando um subconjunto de células tumorais migratórias e invasivo. Métodos atuais para análise da via de sinalização focar em modelos de ponto de extremidade, que muitas vezes tentam medir sinalização post-hoc de evento biológico e não refletem a natureza progressiva da doença. Aqui, demonstramos um romance adenovírus repórter sistema específico para a via de sinalização do TGF-β/Smad3 que pode detectar a ativação transcricional de células vivas. Utilizing an Ad-CAGA12-Td-Tom reporter, we can achieve a 100% infection rate of MDA-MB-231 cells within 24 h in vitro. O uso de um repórter fluorescente permite para a imagem latente de células únicas ao vivo em tempo real com a identificação directa das células transcricionalmente ativas. Estimulação de células infectadas com TGF-β exibe apenas um subconjunto de células que são transcricionalmente ativo e envolvido em funções biológicas específicas. Esta abordagem permite alta especificidade e sensibilidade em um nível de célula única para melhorar a compreensão das funções biológicas relacionadas com o TGF-β sinalização em vitro. Smad3 transcriptional activity can also be reported in vivo in real-time through the application of an Ad-CAGA12-Luc reporter. Ad-CAGA12-Luc can be measured in the same manner as traditional stably transfected luciferase cell lines. Smad3 atividade transcricional de células implantados no vivo pode ser analisada através de imagens de IVIS convencional e monitorada ao vivo durante a progressão do tumor, proporcionando uma visão única a dinâmica da via de sinalização do TGF-β. Nosso protocolo descreve um sistema de entrega de repórter vantajoso permitindo rápida de imagem de alta produtividade de vias de sinalização de célula viva tanto in vitro e in vivo. Esse método pode ser expandido para uma gama de imagem com base em ensaios e presentes como uma abordagem sensível e reprodutível para biologia básica e desenvolvimento terapêutico.
Introduction
Fator de crescimento transformante β (TGF-β) é uma citocina essencial envolvida no desenvolvimento humano que sinaliza através uma heterodimérica complexa consistindo de tipo II e tipo I receptores1. Vinculação ao tipo do receptor II resultados no recrutamento e na fosforilação do tipo do receptor, que por sua vez, fosforila a jusante Smad2/3 proteínas2,3. Estas ativado Smad2/3 proteínas se ligam a Smad4, formando um complexo que translocates para o núcleo e regula a transcrição de gene4. Sob condições homeostáticas TGF-β/Smad sinalização é fortemente regulamentada; no entanto, em muitas doenças, a via de sinalização é desregulamentada e frequentemente overexpressed levando a progressão da doença5,6,7. Estudos recentes têm demonstrado que a resposta celular ao TGF-β é heterogênea e subpopulações de células ativas de TGF-β/Smad são responsáveis por uma função biológica em uma maneira tempo-dependente8,9. Análise de celular comuns de sinalização do TGF-β/Smad envolve o uso de ensaios de ponto de extremidade fixo que fornecem apenas um instantâneo da atividade celular e muitas vezes dosar a média de efeito de TGF-β/Smad10. Esses métodos, no entanto, podem não representar fielmente os comportamentos moleculares de TGF-β/Smad sinalização no estado fisiológico durante a progressão da doença. Análise baseada em imagem de captura células vivas a dinâmica dos processos celulares e biológicos com ambos uma compreensão espacial e temporal.
Nosso objetivo foi desenvolver um método sensível de alto rendimento para a imagem latente de célula viva de TGF-β/Smad sinalização utilizando reagentes baseados em adenovírus. Aqui, estamos infectados a linha de celular de câncer de mama humano MDA-MB-231 com um adenovírus expressando a sequência de ligação CAGA de Smad3 do motivo e a luciferase (Luc) ou gene repórter de Td-tomate (Td-Tom). Adenovírus repórter sistemas fornecem um método rápido e barato para introdução de plasmídeo que pode resultar em uma taxa de 100% de infecção em linhas de células de câncer. Sistemas de adenovírus repórter também foram aplicados com sucesso ao linhas celulares que são difíceis de transfect com plasmídeo convencional11. Neste protocolo, descreveremos um processo não-invasivo e pode ser reproduzido para alcançar a imagem de célula viva da via de sinalização TGFβ/Smad tanto in vivo e in vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nós desenvolvemos uma técnica para permitir a imagem em tempo real de TGF-β/Smad3 sinalização em células únicas ao vivo. Usando este método novo, anteriormente identificamos uma subpopulação de células com atividade transcricional TGF-β/Smad3 dinâmica que estava associada com invasão reforçada e migração8. Esse método melhora na tradicionais ensaios para sinalização do TGF-β, tais como borrões ocidentais de fosforilação Smad3 e TGF-β direcionados a expressão gênica, capt…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado por doações da saúde nacional e Conselho de pesquisa médica (NHMRC) para H-JZ. TMBW é um destinatário de um prêmio de pós-graduação de Austrália do governo australiano e a bolsa de Top-Up Ann Henderson do Australian Rotary Health em parceira com o Rotary de Templestowe e jante por uma cura.
Materials
| DMEM | ThermoFisher | 1881024 | Warm in 37 °C waterbath before use |
| Foetal Bovine Serum | Scientifix Life | FBS500-S | Heat inactivated before use |
| Recombinant Human TGF-β1 | PEPROTECH | 100-21 | Aliquot in DDW to make final concentration at 10 mg/mL |
| Hoechst-33258 | Tocris Bioscience | 5117 | Dilute in to PBS to make final concentration at 1 μL/mL |
| Luciferase Reporter Assay Kit | Promega | 197897 | Dilute 5x in PBS before use |
| Luminometer | Promega | 9100-002 | |
| Phase contrast fluorescence microscopy | OLYMPUS | IX50 | |
| Centrifuge | eppendorf | 5810 R | |
| VivoGl Luciferin | Promega | P1041 | |
| IVIS Lumina III In Vivo Imaging System | PerkinElmer | CLS136334 | |
| 0.5% Trypsin-EDTA (10x) | ThermoFisher | 15400-054 | Diltue to 0.05% (1x) in PBS |
| Cell Culture Lysis 5x Reagent | Promega | E153A | Dilute to 1x in DDW |
| 10% Formalin | Sigma-Aldrich | F5554-4L | |
| HEK 293A | ThermoFisher | R70507 | |
| MDA-MB-231 | ATCC | CRM-HTB-26 | |
| PRKDC-SCID | Animal Resources Centre | SCIDF6 | |
| Matrigel | Corning | 354234 | |
| Isoflurane | Zoetis | 26675-46-7 | |
| Ethanol | Chem-supply | EA043-10L-P | |
| Refresh Night Time | Allergan | 1750D | Lubricating Eye Ointment |
| Solution | Composition | ||
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | NaH2PO4.2H2O (4 mM); NaHPO4 (16 mM); NaCl (0.12M) | ||
| FBS-DMEM | 5% heat inactivated FBS; 10 μg/mL penicillin; 100 μg/mL streptomycin |
References
- Massague, J., Like, B. Cellular receptors for type beta transforming growth factor. Ligand binding and affinity labeling in human and rodent cell lines. The Journal of biological chemistry. 260, 2636-2645 (1985).
- Xu, L., Chen, Y. G., Massague, J. The nuclear import function of Smad2 is masked by SARA and unmasked by TGFbeta-dependent phosphorylation. Nature Cell Biology. 2, 559-562 (2000).
- Massague, J. TGFbeta signaling in context. Nature reviews. Molecular cell biology. 13, 616-630 (2012).
- Massague, J., Seoane, J., Wotton, D. Smad transcription factors. Genes Development. 19, 2783-2810 (2005).
- Blobe, G. C., Schiemann, W. P., Lodish, H. F. Role of transforming growth factor beta in human disease. The New England journal of medicine. , 1350-1358 (2000).
- Zhu, H. J., Burgess, A. W. Regulation of transforming growth factor-beta signaling. Molecular cell biology research communications : MCBRC. 4, 321-330 (2001).
- Massagué, J. TGFβ in Cancer. Cell. 134, 215-230 (2008).
- Luwor, R. B., et al. Single live cell TGF-beta signaling imaging: breast cancer cell motility and migration is driven by sub-populations of cells with dynamic TGF-beta-Smad3 activity. Molecular cancer. 14, 50 (2015).
- Clarke, D. C., Liu, X. Decoding the quantitative nature of TGF-beta/Smad signaling. Trends in Cell Biol.ogy. 18, 430-442 (2008).
- Zhao, R., Li, N., Xu, J., Li, W., Fang, X. Quantitative single-molecule study of TGF-beta/Smad signaling. Acta Biochimica et Biophysica Sinica (Shanghai). 50, 51-59 (2017).
- Luwor, R. B., et al. New reagents for improved in vitro and in vivo examination of TGF-beta signalling. Growth factors. 29, 211-218 (2011).
- Dennler, S., et al. Direct binding of Smad3 and Smad4 to critical TGF beta-inducible elements in the promoter of human plasminogen activator inhibitor-type 1 gene. EMBO J. 17, 3091-3100 (1998).
- Luwor, R. B., et al. Targeting Stat3 and Smad7 to restore TGF-beta cytostatic regulation of tumor cells in vitro and in vivo. Oncogene. 32, 2433-2441 (2013).
- Reed, L. J., Muench, H. A Simple Method of Estimating Fifty Per Cent Endpoints. American Journal of Epidemiology. 27, 493-497 (1938).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature methods. 9, 671-675 (2012).
- Dennler, S., Prunier, C., Ferrand, N., Gauthier, J. M., Atfi, A. c-Jun inhibits transforming growth factor beta-mediated transcription by repressing Smad3 transcriptional activity. The Journal of biological chemistry. 275, 28858-28865 (2000).
- Fink, S. P., Mikkola, D., Willson, J. K., Markowitz, S. TGF-beta-induced nuclear localization of Smad2 and Smad3 in Smad4 null cancer cell lines. Oncogene. 22, 1317-1323 (2003).
- Zinn, K. R., et al. Noninvasive bioluminescence imaging in small animals. ILAR J. 49, 103-115 (2008).
- Kim, T. K., Eberwine, J. H. Mammalian cell transfection: the present and the future. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397, 3173-3178 (2010).
- Russell, W. C. Update on adenovirus and its vectors. Journal of General Virology. 81, 2573-2604 (2000).
- Lee, C. S., et al. Adenovirus-Mediated Gene Delivery: Potential Applications for Gene and Cell-Based Therapies in the New Era of Personalized Medicine. Genes & Diseases. 4, 43-63 (2017).
- Wang, I. I., Huang, I. I. Adenovirus technology for gene manipulation and functional studies. Drug Discovery Today. 5, 10-16 (2000).
- Kochanek, S., et al. A new adenoviral vector: Replacement of all viral coding sequences with 28 kb of DNA independently expressing both full-length dystrophin and beta-galactosidase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93, 5731-5736 (1996).
- Wang, Q., Finer, M. H. Second-generation adenovirus vectors. Nature Medicine. 2, 714-716 (1996).
- Durham, H. D., et al. Toxicity of replication-defective adenoviral recombinants in dissociated cultures of nervous tissue. Experimental Neurology. 140, 14-20 (1996).
- MacKenzie, K. L., Hackett, N. R., Crystal, R. G., Moore, M. A. Adenoviral vector-mediated gene transfer to primitive human hematopoietic progenitor cells: assessment of transduction and toxicity in long-term culture. Blood. 96, 100-108 (2000).
- Zhang, W. W., Koch, P. E., Roth, J. A. Detection of wild-type contamination in a recombinant adenoviral preparation by PCR. Biotechniques. 18, 444-447 (1995).
- Choi, Y., Chang, J. Viral vectors for vaccine applications. Clinical and Experimental Vaccine Research. 2, 97-105 (2013).
- de Cassan, S. C., et al. The requirement for potent adjuvants to enhance the immunogenicity and protective efficacy of protein vaccines can be overcome by prior immunization with a recombinant adenovirus. Journal of immunology. 187, 2602-2616 (2011).
- Krasnykh, V. N., Mikheeva, G. V., Douglas, J. T., Curiel, D. T. Generation of recombinant adenovirus vectors with modified fibers for altering viral tropism. Journal of Virology. 70, 6839-6846 (1996).
- Wickham, T. J., et al. Increased in vitro and in vivo gene transfer by adenovirus vectors containing chimeric fiber proteins. Journal of Virology. 71, 8221-8229 (1997).
- Smith, F., Jacoby, D., Breakefield, X. O. Virus vectors for gene delivery to the nervous system. Restorative neurology and neuroscience. 8, 21-34 (1995).
- Zhou, F., et al. Nuclear receptor NR4A1 promotes breast cancer invasion and metastasis by activating TGF-beta signalling. Nature communications. 5, 3388 (2014).
