Live celle billeddannelse af den TGF-β/Smad3 Signaling Pathway In Vitro og In Vivo ved hjælp af en Adenovirus Reporter System
Summary
Vi præsenterer her, en protokol for levende celle billeddannelse af TGF-β/Smad3 signaling aktivitet ved hjælp af en adenovirus reporter system. Dette system registrerer transcriptional aktiviteten i realtid og kan anvendes til både enkelt celler in vitro- og i levende dyrmodeller.
Abstract
Omdanne vækst faktor β (TGF-β) signalering regulerer mange vigtige funktioner, der kræves for cellulære homøostase og er almindeligt forekommende overexpressed i mange sygdomme, herunder kræft. TGF-β er stærkt impliceret i metastase i sent stadium kræft progression, aktivere et undersæt af vandrende og invasive tumorceller. Nuværende metoder til signalering pathway analyse fokuserer på slutpunktet modeller, som ofte forsøger at måle signaling post-hoc af hændelsen biologiske og afspejler ikke den progressive karakter af sygdommen. Her viser vi en roman adenovirus reporter system bestemt til TGF-β/Smad3 signalvejen, der kan registrere transcriptional aktivering i levende celler. Udnytte en Ad-CAGA12-Td-Tom reporter, kan vi opnå en 100% infektion sats af MDA-MB-231 celler inden for 24 timer in vitro. Brug af en fluorescerende reporter giver mulighed for billeddannelse af levende enkelt celler i realtid med direkte identifikation af transcriptionally aktive celler. Stimulation af inficerede celler med TGF-β viser kun et undersæt af celler, der transcriptionally aktiv og involveret i specifikke biologiske funktioner. Denne tilgang giver mulighed for høj specificitet og sensitivitet på en enkelt celle plan at øge forståelse af biologiske funktioner relateret til TGF-β signalering i vitro. Smad3 transcriptional aktivitet kan også blive rapporteret i vivo i realtid gennem anvendelse af en Ad-CAGA12– Luc reporter. Ad-CAGA12– Luc kan måles på samme måde som traditionelle stabilt transfekteret luciferase cellelinjer. Smad3 transcriptional aktivitet af celler implanteret i vivo kan analyseres via konventionelle IVIS imaging og overvåges live under tumor progression, giver enestående indsigt i dynamikken i TGF-β signalvejen. Vores protokol beskriver en fordelagtig reporter leveringssystem giver mulighed for hurtig høj overførselshastighed billeddannelse af levende celle signalering veje både in vitro- og in vivo. Denne metode kan udvides til en række billede baseret assays og gaver som en følsom og reproducerbare tilgang til grundlæggende biologi og terapeutisk udvikling.
Introduction
Omdanne vækst faktor β (TGF-β) er en afgørende cytokin impliceret i den menneskelige udvikling, der signalerer gennem en kompleks bestående af type II heterodimerisk og type I-receptorer1. Bindende skrive II receptor resulterer i rekruttering og fosforylering af typen receptor, hvilket igen phosphorylates downstream Smad2/3 proteiner2,3. Disse aktiveret Smad2/3 proteiner binder sig til Smad4, danner et kompleks, der translocates ind i kernen og regulerer gen transskription4. Homeostatiske betingelser TGF-β/Smad er signalering stramt reguleret; men i mange sygdomme, den signalvejen er dereguleret og ofte overexpressed fører til progression af sygdommen5,6,7. Nylige undersøgelser har vist at cellulære reaktion på TGF-β er heterogene og delpopulationer af TGF-β/Smad aktive celler er ansvarlige for biologiske funktion i en tidsafhængig måde8,9. Fælles cellulære analyse af TGF-β/Smad signalering indebærer anvendelse af fast slutpunkt assays, der giver kun et øjebliksbillede af cellulære aktivitet og ofte kvantificere den gennemsnitlige TGF-β/Smad effekt10. Disse metoder, men kan ikke præcist repræsenterer den molekylære opførsel af TGF-β/Smad signalering i de fysiologiske tilstand i løbet af sygdomsprogression. Image-baseret analyse af levende celler fange dynamikken i cellulære og biologiske processer med begge en rumlig og tidsmæssig forståelse.
Vores mål var at udvikle en følsom høj overførselshastighed metode for levende celle billeddannelse af TGF-β/Smad signalering adenovirus-baserede reagenser. Her, inficeret vi menneskers breast cancer cellelinie MDA-MB-231 med en adenovirus udtryk for Smad3 CAGA motiv bindende sekvens og en luciferase (Luc) eller Td-tomat (Td-Tom) reporter gen. Adenoviral reporter systemer giver en hurtig og billig metode til plasmid introduktion, der kan resultere i en 100% infektion sats i kræft cellelinjer. Adenoviral reporter systemer har også været anvendt med succes til cellelinjer, der er svært at transfect med konventionelle plasmid11. I denne protokol vil vi beskrive en reproducerbar og noninvasive proces for at opnå levende celle billeddannelse af TGFβ/Smad signalvejen både i vivo og in vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi har udviklet en teknik til at give mulighed for real-time imaging af TGF-β/Smad3 signalering i enkelt levende celler. Brug af denne nye metode, har vi tidligere konstateret en delpopulation af celler med dynamisk TGF-β/Smad3 transcriptional aktivitet, der var forbundet med forøget invasion og migration8. Denne metode forbedrer på traditionelle assays til TGF-β signalering, såsom western blotting af Smad3 fosforylering og TGF-β målrettet genekspression, ved at indfange heterogeniteten af…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National sundhed og Medical Research Rådet (NHMRC) til H-JZ. TMBW er en modtager af en Australien Postgraduate Award fra den australske regering og Ann Henderson Top-Up stipendium fra australske Rotary sundhed i partner med Rotary i Virum og Spis efter en kur.
Materials
| DMEM | ThermoFisher | 1881024 | Warm in 37 °C waterbath before use |
| Foetal Bovine Serum | Scientifix Life | FBS500-S | Heat inactivated before use |
| Recombinant Human TGF-β1 | PEPROTECH | 100-21 | Aliquot in DDW to make final concentration at 10 mg/mL |
| Hoechst-33258 | Tocris Bioscience | 5117 | Dilute in to PBS to make final concentration at 1 μL/mL |
| Luciferase Reporter Assay Kit | Promega | 197897 | Dilute 5x in PBS before use |
| Luminometer | Promega | 9100-002 | |
| Phase contrast fluorescence microscopy | OLYMPUS | IX50 | |
| Centrifuge | eppendorf | 5810 R | |
| VivoGl Luciferin | Promega | P1041 | |
| IVIS Lumina III In Vivo Imaging System | PerkinElmer | CLS136334 | |
| 0.5% Trypsin-EDTA (10x) | ThermoFisher | 15400-054 | Diltue to 0.05% (1x) in PBS |
| Cell Culture Lysis 5x Reagent | Promega | E153A | Dilute to 1x in DDW |
| 10% Formalin | Sigma-Aldrich | F5554-4L | |
| HEK 293A | ThermoFisher | R70507 | |
| MDA-MB-231 | ATCC | CRM-HTB-26 | |
| PRKDC-SCID | Animal Resources Centre | SCIDF6 | |
| Matrigel | Corning | 354234 | |
| Isoflurane | Zoetis | 26675-46-7 | |
| Ethanol | Chem-supply | EA043-10L-P | |
| Refresh Night Time | Allergan | 1750D | Lubricating Eye Ointment |
| Solution | Composition | ||
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | NaH2PO4.2H2O (4 mM); NaHPO4 (16 mM); NaCl (0.12M) | ||
| FBS-DMEM | 5% heat inactivated FBS; 10 μg/mL penicillin; 100 μg/mL streptomycin |
References
- Massague, J., Like, B. Cellular receptors for type beta transforming growth factor. Ligand binding and affinity labeling in human and rodent cell lines. The Journal of biological chemistry. 260, 2636-2645 (1985).
- Xu, L., Chen, Y. G., Massague, J. The nuclear import function of Smad2 is masked by SARA and unmasked by TGFbeta-dependent phosphorylation. Nature Cell Biology. 2, 559-562 (2000).
- Massague, J. TGFbeta signaling in context. Nature reviews. Molecular cell biology. 13, 616-630 (2012).
- Massague, J., Seoane, J., Wotton, D. Smad transcription factors. Genes Development. 19, 2783-2810 (2005).
- Blobe, G. C., Schiemann, W. P., Lodish, H. F. Role of transforming growth factor beta in human disease. The New England journal of medicine. , 1350-1358 (2000).
- Zhu, H. J., Burgess, A. W. Regulation of transforming growth factor-beta signaling. Molecular cell biology research communications : MCBRC. 4, 321-330 (2001).
- Massagué, J. TGFβ in Cancer. Cell. 134, 215-230 (2008).
- Luwor, R. B., et al. Single live cell TGF-beta signaling imaging: breast cancer cell motility and migration is driven by sub-populations of cells with dynamic TGF-beta-Smad3 activity. Molecular cancer. 14, 50 (2015).
- Clarke, D. C., Liu, X. Decoding the quantitative nature of TGF-beta/Smad signaling. Trends in Cell Biol.ogy. 18, 430-442 (2008).
- Zhao, R., Li, N., Xu, J., Li, W., Fang, X. Quantitative single-molecule study of TGF-beta/Smad signaling. Acta Biochimica et Biophysica Sinica (Shanghai). 50, 51-59 (2017).
- Luwor, R. B., et al. New reagents for improved in vitro and in vivo examination of TGF-beta signalling. Growth factors. 29, 211-218 (2011).
- Dennler, S., et al. Direct binding of Smad3 and Smad4 to critical TGF beta-inducible elements in the promoter of human plasminogen activator inhibitor-type 1 gene. EMBO J. 17, 3091-3100 (1998).
- Luwor, R. B., et al. Targeting Stat3 and Smad7 to restore TGF-beta cytostatic regulation of tumor cells in vitro and in vivo. Oncogene. 32, 2433-2441 (2013).
- Reed, L. J., Muench, H. A Simple Method of Estimating Fifty Per Cent Endpoints. American Journal of Epidemiology. 27, 493-497 (1938).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature methods. 9, 671-675 (2012).
- Dennler, S., Prunier, C., Ferrand, N., Gauthier, J. M., Atfi, A. c-Jun inhibits transforming growth factor beta-mediated transcription by repressing Smad3 transcriptional activity. The Journal of biological chemistry. 275, 28858-28865 (2000).
- Fink, S. P., Mikkola, D., Willson, J. K., Markowitz, S. TGF-beta-induced nuclear localization of Smad2 and Smad3 in Smad4 null cancer cell lines. Oncogene. 22, 1317-1323 (2003).
- Zinn, K. R., et al. Noninvasive bioluminescence imaging in small animals. ILAR J. 49, 103-115 (2008).
- Kim, T. K., Eberwine, J. H. Mammalian cell transfection: the present and the future. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397, 3173-3178 (2010).
- Russell, W. C. Update on adenovirus and its vectors. Journal of General Virology. 81, 2573-2604 (2000).
- Lee, C. S., et al. Adenovirus-Mediated Gene Delivery: Potential Applications for Gene and Cell-Based Therapies in the New Era of Personalized Medicine. Genes & Diseases. 4, 43-63 (2017).
- Wang, I. I., Huang, I. I. Adenovirus technology for gene manipulation and functional studies. Drug Discovery Today. 5, 10-16 (2000).
- Kochanek, S., et al. A new adenoviral vector: Replacement of all viral coding sequences with 28 kb of DNA independently expressing both full-length dystrophin and beta-galactosidase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93, 5731-5736 (1996).
- Wang, Q., Finer, M. H. Second-generation adenovirus vectors. Nature Medicine. 2, 714-716 (1996).
- Durham, H. D., et al. Toxicity of replication-defective adenoviral recombinants in dissociated cultures of nervous tissue. Experimental Neurology. 140, 14-20 (1996).
- MacKenzie, K. L., Hackett, N. R., Crystal, R. G., Moore, M. A. Adenoviral vector-mediated gene transfer to primitive human hematopoietic progenitor cells: assessment of transduction and toxicity in long-term culture. Blood. 96, 100-108 (2000).
- Zhang, W. W., Koch, P. E., Roth, J. A. Detection of wild-type contamination in a recombinant adenoviral preparation by PCR. Biotechniques. 18, 444-447 (1995).
- Choi, Y., Chang, J. Viral vectors for vaccine applications. Clinical and Experimental Vaccine Research. 2, 97-105 (2013).
- de Cassan, S. C., et al. The requirement for potent adjuvants to enhance the immunogenicity and protective efficacy of protein vaccines can be overcome by prior immunization with a recombinant adenovirus. Journal of immunology. 187, 2602-2616 (2011).
- Krasnykh, V. N., Mikheeva, G. V., Douglas, J. T., Curiel, D. T. Generation of recombinant adenovirus vectors with modified fibers for altering viral tropism. Journal of Virology. 70, 6839-6846 (1996).
- Wickham, T. J., et al. Increased in vitro and in vivo gene transfer by adenovirus vectors containing chimeric fiber proteins. Journal of Virology. 71, 8221-8229 (1997).
- Smith, F., Jacoby, D., Breakefield, X. O. Virus vectors for gene delivery to the nervous system. Restorative neurology and neuroscience. 8, 21-34 (1995).
- Zhou, F., et al. Nuclear receptor NR4A1 promotes breast cancer invasion and metastasis by activating TGF-beta signalling. Nature communications. 5, 3388 (2014).
