Vi præsenterer her, en protokol for levende celle billeddannelse af TGF-β/Smad3 signaling aktivitet ved hjælp af en adenovirus reporter system. Dette system registrerer transcriptional aktiviteten i realtid og kan anvendes til både enkelt celler in vitro- og i levende dyrmodeller.
Omdanne vækst faktor β (TGF-β) signalering regulerer mange vigtige funktioner, der kræves for cellulære homøostase og er almindeligt forekommende overexpressed i mange sygdomme, herunder kræft. TGF-β er stærkt impliceret i metastase i sent stadium kræft progression, aktivere et undersæt af vandrende og invasive tumorceller. Nuværende metoder til signalering pathway analyse fokuserer på slutpunktet modeller, som ofte forsøger at måle signaling post-hoc af hændelsen biologiske og afspejler ikke den progressive karakter af sygdommen. Her viser vi en roman adenovirus reporter system bestemt til TGF-β/Smad3 signalvejen, der kan registrere transcriptional aktivering i levende celler. Udnytte en Ad-CAGA12-Td-Tom reporter, kan vi opnå en 100% infektion sats af MDA-MB-231 celler inden for 24 timer in vitro. Brug af en fluorescerende reporter giver mulighed for billeddannelse af levende enkelt celler i realtid med direkte identifikation af transcriptionally aktive celler. Stimulation af inficerede celler med TGF-β viser kun et undersæt af celler, der transcriptionally aktiv og involveret i specifikke biologiske funktioner. Denne tilgang giver mulighed for høj specificitet og sensitivitet på en enkelt celle plan at øge forståelse af biologiske funktioner relateret til TGF-β signalering i vitro. Smad3 transcriptional aktivitet kan også blive rapporteret i vivo i realtid gennem anvendelse af en Ad-CAGA12– Luc reporter. Ad-CAGA12– Luc kan måles på samme måde som traditionelle stabilt transfekteret luciferase cellelinjer. Smad3 transcriptional aktivitet af celler implanteret i vivo kan analyseres via konventionelle IVIS imaging og overvåges live under tumor progression, giver enestående indsigt i dynamikken i TGF-β signalvejen. Vores protokol beskriver en fordelagtig reporter leveringssystem giver mulighed for hurtig høj overførselshastighed billeddannelse af levende celle signalering veje både in vitro- og in vivo. Denne metode kan udvides til en række billede baseret assays og gaver som en følsom og reproducerbare tilgang til grundlæggende biologi og terapeutisk udvikling.
Omdanne vækst faktor β (TGF-β) er en afgørende cytokin impliceret i den menneskelige udvikling, der signalerer gennem en kompleks bestående af type II heterodimerisk og type I-receptorer1. Bindende skrive II receptor resulterer i rekruttering og fosforylering af typen receptor, hvilket igen phosphorylates downstream Smad2/3 proteiner2,3. Disse aktiveret Smad2/3 proteiner binder sig til Smad4, danner et kompleks, der translocates ind i kernen og regulerer gen transskription4. Homeostatiske betingelser TGF-β/Smad er signalering stramt reguleret; men i mange sygdomme, den signalvejen er dereguleret og ofte overexpressed fører til progression af sygdommen5,6,7. Nylige undersøgelser har vist at cellulære reaktion på TGF-β er heterogene og delpopulationer af TGF-β/Smad aktive celler er ansvarlige for biologiske funktion i en tidsafhængig måde8,9. Fælles cellulære analyse af TGF-β/Smad signalering indebærer anvendelse af fast slutpunkt assays, der giver kun et øjebliksbillede af cellulære aktivitet og ofte kvantificere den gennemsnitlige TGF-β/Smad effekt10. Disse metoder, men kan ikke præcist repræsenterer den molekylære opførsel af TGF-β/Smad signalering i de fysiologiske tilstand i løbet af sygdomsprogression. Image-baseret analyse af levende celler fange dynamikken i cellulære og biologiske processer med begge en rumlig og tidsmæssig forståelse.
Vores mål var at udvikle en følsom høj overførselshastighed metode for levende celle billeddannelse af TGF-β/Smad signalering adenovirus-baserede reagenser. Her, inficeret vi menneskers breast cancer cellelinie MDA-MB-231 med en adenovirus udtryk for Smad3 CAGA motiv bindende sekvens og en luciferase (Luc) eller Td-tomat (Td-Tom) reporter gen. Adenoviral reporter systemer giver en hurtig og billig metode til plasmid introduktion, der kan resultere i en 100% infektion sats i kræft cellelinjer. Adenoviral reporter systemer har også været anvendt med succes til cellelinjer, der er svært at transfect med konventionelle plasmid11. I denne protokol vil vi beskrive en reproducerbar og noninvasive proces for at opnå levende celle billeddannelse af TGFβ/Smad signalvejen både i vivo og in vitro.
Vi har udviklet en teknik til at give mulighed for real-time imaging af TGF-β/Smad3 signalering i enkelt levende celler. Brug af denne nye metode, har vi tidligere konstateret en delpopulation af celler med dynamisk TGF-β/Smad3 transcriptional aktivitet, der var forbundet med forøget invasion og migration8. Denne metode forbedrer på traditionelle assays til TGF-β signalering, såsom western blotting af Smad3 fosforylering og TGF-β målrettet genekspression, ved at indfange heterogeniteten af…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National sundhed og Medical Research Rådet (NHMRC) til H-JZ. TMBW er en modtager af en Australien Postgraduate Award fra den australske regering og Ann Henderson Top-Up stipendium fra australske Rotary sundhed i partner med Rotary i Virum og Spis efter en kur.
DMEM | ThermoFisher | 1881024 | Warm in 37 °C waterbath before use |
Foetal Bovine Serum | Scientifix Life | FBS500-S | Heat inactivated before use |
Recombinant Human TGF-β1 | PEPROTECH | 100-21 | Aliquot in DDW to make final concentration at 10 mg/mL |
Hoechst-33258 | Tocris Bioscience | 5117 | Dilute in to PBS to make final concentration at 1 μL/mL |
Luciferase Reporter Assay Kit | Promega | 197897 | Dilute 5x in PBS before use |
Luminometer | Promega | 9100-002 | |
Phase contrast fluorescence microscopy | OLYMPUS | IX50 | |
Centrifuge | eppendorf | 5810 R | |
VivoGl Luciferin | Promega | P1041 | |
IVIS Lumina III In Vivo Imaging System | PerkinElmer | CLS136334 | |
0.5% Trypsin-EDTA (10x) | ThermoFisher | 15400-054 | Diltue to 0.05% (1x) in PBS |
Cell Culture Lysis 5x Reagent | Promega | E153A | Dilute to 1x in DDW |
10% Formalin | Sigma-Aldrich | F5554-4L | |
HEK 293A | ThermoFisher | R70507 | |
MDA-MB-231 | ATCC | CRM-HTB-26 | |
PRKDC-SCID | Animal Resources Centre | SCIDF6 | |
Matrigel | Corning | 354234 | |
Isoflurane | Zoetis | 26675-46-7 | |
Ethanol | Chem-supply | EA043-10L-P | |
Refresh Night Time | Allergan | 1750D | Lubricating Eye Ointment |
Solution | Composition | ||
Phosphate-Buffered Saline (PBS) | NaH2PO4.2H2O (4 mM); NaHPO4 (16 mM); NaCl (0.12M) | ||
FBS-DMEM | 5% heat inactivated FBS; 10 μg/mL penicillin; 100 μg/mL streptomycin |