Live celle avbildning av den TGF-β/Smad3 signalnettverk Pathway In Vitro og i Vivo bruker en Adenovirus Reporter System
Summary
Her presenterer vi en protokoll for levende celle imaging TGF-β/Smad3 signalnettverk aktivitet ved hjelp av en adenovirus reporter system. Systemet sporer transcriptional aktivitet i sanntid og kan brukes til både enkeltceller i vitro og i levende dyrmodeller.
Abstract
Transformasjon av vekstfaktor β (TGF-β) signalering regulerer mange viktige funksjoner som kreves for mobilnettet homeostase og er vanligvis grunnlegge overexpressed i mange sykdommer, inkludert kreft. TGF-β er sterkt involvert i metastasering under sent stadium kreft progresjon, aktivere et delsett av trekkfugler og invasive kreftceller. Gjeldende metoder for signalering sti analyse fokuserer på sluttpunktet modeller, som ofte forsøker å måle signalnettverk innlegg-hoc av biologiske hendelsen og reflekterer ikke progressive natur sykdommen. Her viser vi en roman adenovirus reporter systemet bestemt for den TGF-β/Smad3 signalveien som kan oppdage transcriptional aktivisering i levende celler. Bruker en Ad-CAGA12-Td-Tom reporter, kan vi oppnå en 100% infeksjon rate av MDA-MB-231 celler i 24 h i vitro. Bruk av fluorescerende reporter tillater avbilding av live enkeltceller i sanntid med direkte identifikasjon av transcriptionally aktive celler. Stimulering av infiserte celler med TGF-β viser bare et delsett av celler som er transcriptionally aktive og involverte i bestemte biologiske funksjoner. Denne tilnærmingen gir høy spesifisitet og følsomhet på en enkelt cellenivå å øke forståelsen av biologiske funksjoner knyttet til TGF-β signalnettverk i vitro. Smad3 transcriptional aktivitet kan også rapportert i vivo i sanntid gjennom bruk av en Ad-CAGA12– Luc reporter. Ad-CAGA12– Luc kan måles på samme måte som tradisjonelle stabilt transfekterte luciferase linjer. Smad3 transcriptional aktiviteten til cellene implantert i vivo kan analyseres gjennom konvensjonelle IVIS avbildning og overvåket live under svulst progresjon, gir unik innsikt i dynamikken i TGF-β signalveien. Våre protokollen beskriver en fordelaktig reporter leveringssystem muliggjør rask høy gjennomstrømming avbilding av levende celle signalnettverk trasé både i vitro og i vivo. Denne metoden kan utvides til en rekke bilde basert analyser og gaver som en følsom og reproduserbar tilnærming til både grunnleggende biologi og terapeutiske utvikling.
Introduction
Transformasjon av vekstfaktor β (TGF-β) er en viktig cytokin innblandet i menneskelig utvikling som signaliserer gjennom en heterodimeric består av type II og type I-reseptorer1. Binding til type II reseptor resulterer i rekruttering og fosforylering typen jeg reseptoren, som i sin tur phosphorylates nedstrøms Smad2/3 proteiner2,3. Dette aktivert Smad2/3 proteiner binde til Smad4, danner et kompleks som translocates til kjernen og regulerer genet transkripsjon4. Under homøostatisk forhold TGF-β/Smad er signalering strengt regulert; men i mange sykdommer, signalveien er deregulert og ofte overexpressed fører til progresjon av sykdommen5,6,7. Nyere studier har vist at cellulær respons til TGF-β er heterogene og subpopulasjoner av TGF-β/Smad aktive cellene er ansvarlige for biologisk funksjon i en tidsavhengige måte8,9. Vanlige mobilnettet analyse av TGF-β/Smad signalering innebærer bruk av fast endepunktet analyser som gir bare et øyeblikksbilde av cellulære aktiviteten og ofte quantitate gjennomsnittlig TGF-β/Smad effekt10. Disse metodene, men kan ikke nøyaktig representere molekylær oppførsel av TGF-β/Smad signalering i fysiologisk tilstand under sykdomsprogresjon. Image-basert analyse av lever celler fange dynamikken i mobilnettet og biologiske prosesser med både en romlig og timelige forståelse.
Målet var å utvikle en følsom høy gjennomstrømming metode for levende celle avbilding av TGF-β/Smad signalering bruker adenovirus-baserte reagenser. Her infisert vi menneskelig bryst kreft cellen linjen MDA-MB-231 med en adenovirus uttrykke Smad3 CAGA motiv bindende sekvensen og luciferase (Luc) eller Td-tomat (Td-Tom) reporter genet. Adenoviral reporter systemer er en rask og billig metode for plasmider introduksjon som kan resultere i en 100% infeksjon rate i kreftcelle linjer. Adenoviral reporter systemer har også vært anvendt på linjer som er vanskelige å transfect med konvensjonelle plasmider11. I denne protokollen vil vi beskrive en reproduserbar og noninvasive prosess for å oppnå levende celle avbildning av TGFβ/Smad-signalveien både i vivo og i vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi har utviklet en teknikk for å muliggjøre sanntids avbilding av TGF-β/Smad3 signalering i live enkeltceller. Bruker denne romanen metoden, har vi tidligere identifisert en sub-populasjon av celler med dynamisk TGF-β/Smad3 transcriptional aktivitet som ble tilknyttet forbedret invasjon og overføring8. Denne metoden forbedrer på tradisjonelle analyser for TGF-β signalnettverk, som vestlige blots av Smad3 fosforylering og TGF-β målrettet genuttrykk, ved å fange heterogenitet av TGF-β/Sma…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra National Health and Medical Research Council (NHMRC) til H-JZ. TMBW er en mottaker av en Australia Postgraduate Award fra den australske regjeringen og Ann Henderson påfylling stipend fra australske Rotary helse i partner med roterende av Templestowe og Dine for en kur.
Materials
| DMEM | ThermoFisher | 1881024 | Warm in 37 °C waterbath before use |
| Foetal Bovine Serum | Scientifix Life | FBS500-S | Heat inactivated before use |
| Recombinant Human TGF-β1 | PEPROTECH | 100-21 | Aliquot in DDW to make final concentration at 10 mg/mL |
| Hoechst-33258 | Tocris Bioscience | 5117 | Dilute in to PBS to make final concentration at 1 μL/mL |
| Luciferase Reporter Assay Kit | Promega | 197897 | Dilute 5x in PBS before use |
| Luminometer | Promega | 9100-002 | |
| Phase contrast fluorescence microscopy | OLYMPUS | IX50 | |
| Centrifuge | eppendorf | 5810 R | |
| VivoGl Luciferin | Promega | P1041 | |
| IVIS Lumina III In Vivo Imaging System | PerkinElmer | CLS136334 | |
| 0.5% Trypsin-EDTA (10x) | ThermoFisher | 15400-054 | Diltue to 0.05% (1x) in PBS |
| Cell Culture Lysis 5x Reagent | Promega | E153A | Dilute to 1x in DDW |
| 10% Formalin | Sigma-Aldrich | F5554-4L | |
| HEK 293A | ThermoFisher | R70507 | |
| MDA-MB-231 | ATCC | CRM-HTB-26 | |
| PRKDC-SCID | Animal Resources Centre | SCIDF6 | |
| Matrigel | Corning | 354234 | |
| Isoflurane | Zoetis | 26675-46-7 | |
| Ethanol | Chem-supply | EA043-10L-P | |
| Refresh Night Time | Allergan | 1750D | Lubricating Eye Ointment |
| Solution | Composition | ||
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | NaH2PO4.2H2O (4 mM); NaHPO4 (16 mM); NaCl (0.12M) | ||
| FBS-DMEM | 5% heat inactivated FBS; 10 μg/mL penicillin; 100 μg/mL streptomycin |
References
- Massague, J., Like, B. Cellular receptors for type beta transforming growth factor. Ligand binding and affinity labeling in human and rodent cell lines. The Journal of biological chemistry. 260, 2636-2645 (1985).
- Xu, L., Chen, Y. G., Massague, J. The nuclear import function of Smad2 is masked by SARA and unmasked by TGFbeta-dependent phosphorylation. Nature Cell Biology. 2, 559-562 (2000).
- Massague, J. TGFbeta signaling in context. Nature reviews. Molecular cell biology. 13, 616-630 (2012).
- Massague, J., Seoane, J., Wotton, D. Smad transcription factors. Genes Development. 19, 2783-2810 (2005).
- Blobe, G. C., Schiemann, W. P., Lodish, H. F. Role of transforming growth factor beta in human disease. The New England journal of medicine. , 1350-1358 (2000).
- Zhu, H. J., Burgess, A. W. Regulation of transforming growth factor-beta signaling. Molecular cell biology research communications : MCBRC. 4, 321-330 (2001).
- Massagué, J. TGFβ in Cancer. Cell. 134, 215-230 (2008).
- Luwor, R. B., et al. Single live cell TGF-beta signaling imaging: breast cancer cell motility and migration is driven by sub-populations of cells with dynamic TGF-beta-Smad3 activity. Molecular cancer. 14, 50 (2015).
- Clarke, D. C., Liu, X. Decoding the quantitative nature of TGF-beta/Smad signaling. Trends in Cell Biol.ogy. 18, 430-442 (2008).
- Zhao, R., Li, N., Xu, J., Li, W., Fang, X. Quantitative single-molecule study of TGF-beta/Smad signaling. Acta Biochimica et Biophysica Sinica (Shanghai). 50, 51-59 (2017).
- Luwor, R. B., et al. New reagents for improved in vitro and in vivo examination of TGF-beta signalling. Growth factors. 29, 211-218 (2011).
- Dennler, S., et al. Direct binding of Smad3 and Smad4 to critical TGF beta-inducible elements in the promoter of human plasminogen activator inhibitor-type 1 gene. EMBO J. 17, 3091-3100 (1998).
- Luwor, R. B., et al. Targeting Stat3 and Smad7 to restore TGF-beta cytostatic regulation of tumor cells in vitro and in vivo. Oncogene. 32, 2433-2441 (2013).
- Reed, L. J., Muench, H. A Simple Method of Estimating Fifty Per Cent Endpoints. American Journal of Epidemiology. 27, 493-497 (1938).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature methods. 9, 671-675 (2012).
- Dennler, S., Prunier, C., Ferrand, N., Gauthier, J. M., Atfi, A. c-Jun inhibits transforming growth factor beta-mediated transcription by repressing Smad3 transcriptional activity. The Journal of biological chemistry. 275, 28858-28865 (2000).
- Fink, S. P., Mikkola, D., Willson, J. K., Markowitz, S. TGF-beta-induced nuclear localization of Smad2 and Smad3 in Smad4 null cancer cell lines. Oncogene. 22, 1317-1323 (2003).
- Zinn, K. R., et al. Noninvasive bioluminescence imaging in small animals. ILAR J. 49, 103-115 (2008).
- Kim, T. K., Eberwine, J. H. Mammalian cell transfection: the present and the future. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397, 3173-3178 (2010).
- Russell, W. C. Update on adenovirus and its vectors. Journal of General Virology. 81, 2573-2604 (2000).
- Lee, C. S., et al. Adenovirus-Mediated Gene Delivery: Potential Applications for Gene and Cell-Based Therapies in the New Era of Personalized Medicine. Genes & Diseases. 4, 43-63 (2017).
- Wang, I. I., Huang, I. I. Adenovirus technology for gene manipulation and functional studies. Drug Discovery Today. 5, 10-16 (2000).
- Kochanek, S., et al. A new adenoviral vector: Replacement of all viral coding sequences with 28 kb of DNA independently expressing both full-length dystrophin and beta-galactosidase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93, 5731-5736 (1996).
- Wang, Q., Finer, M. H. Second-generation adenovirus vectors. Nature Medicine. 2, 714-716 (1996).
- Durham, H. D., et al. Toxicity of replication-defective adenoviral recombinants in dissociated cultures of nervous tissue. Experimental Neurology. 140, 14-20 (1996).
- MacKenzie, K. L., Hackett, N. R., Crystal, R. G., Moore, M. A. Adenoviral vector-mediated gene transfer to primitive human hematopoietic progenitor cells: assessment of transduction and toxicity in long-term culture. Blood. 96, 100-108 (2000).
- Zhang, W. W., Koch, P. E., Roth, J. A. Detection of wild-type contamination in a recombinant adenoviral preparation by PCR. Biotechniques. 18, 444-447 (1995).
- Choi, Y., Chang, J. Viral vectors for vaccine applications. Clinical and Experimental Vaccine Research. 2, 97-105 (2013).
- de Cassan, S. C., et al. The requirement for potent adjuvants to enhance the immunogenicity and protective efficacy of protein vaccines can be overcome by prior immunization with a recombinant adenovirus. Journal of immunology. 187, 2602-2616 (2011).
- Krasnykh, V. N., Mikheeva, G. V., Douglas, J. T., Curiel, D. T. Generation of recombinant adenovirus vectors with modified fibers for altering viral tropism. Journal of Virology. 70, 6839-6846 (1996).
- Wickham, T. J., et al. Increased in vitro and in vivo gene transfer by adenovirus vectors containing chimeric fiber proteins. Journal of Virology. 71, 8221-8229 (1997).
- Smith, F., Jacoby, D., Breakefield, X. O. Virus vectors for gene delivery to the nervous system. Restorative neurology and neuroscience. 8, 21-34 (1995).
- Zhou, F., et al. Nuclear receptor NR4A1 promotes breast cancer invasion and metastasis by activating TGF-beta signalling. Nature communications. 5, 3388 (2014).
