Цифровая ПЦР для количественного определения циркулирующих микроРНК в острый инфаркт миокарда и сердечно-сосудистых заболеваний
Summary
Циркулирующих микроРНК показали обещание качестве биомаркеров для сердечно-сосудистых заболеваний и острого инфаркта миокарда. В этом исследовании мы описываем протокол для извлечения Мирна, обратной транскрипции и цифровой ПЦР для количественной оценки абсолютной интерферирующим в сыворотке крови больных с сердечно-сосудистыми заболеваниями.
Abstract
Циркулирующих сыворотки микроРНК (интерферирующим) показали обещание качестве биомаркеров для сердечно-сосудистых заболеваний и острого инфаркта миокарда (ами), освобождаются от сердечно-сосудистых клеток в кровоток. Циркулирующих интерферирующим очень стабильны и могут быть количественно. Количественном выражении конкретных интерферирующим могут быть связаны с патологии и некоторые интерферирующим шоу высокого ткани и специфики болезней. Поиск нового биомаркерами для сердечно-сосудистых заболеваний имеет важное значение для медицинских исследований. Совсем недавно была изобретена цифровая полимеразной цепной реакции (dPCR). dPCR, в сочетании с флуоресцентные гидролиза зонды, позволяет конкретных прямых абсолютной количественной оценки. dPCR демонстрирует превосходные технические качества, включая низкий изменчивость, высокой линейности и высокой чувствительностью по сравнению с количественным полимеразной цепной реакции (ПЦР). Таким образом dPCR является более точные и воспроизводимые метод непосредственно количественной оценки адаптивной, особенно для использования в больших Multi-центр сердечно-сосудистой системы клинических испытаний. В этом издании мы опишем, как для эффективного выполнения цифровой ПЦР с целью оценки абсолютной копией номер в образцах сыворотки.
Introduction
Циркулирующих интерферирующим были определены как перспективные маркеров для целого ряда заболеваний, в том числе сердечно-сосудистых заболеваний1. Интерферирующим малы, -кодирования молекулы одноцепочечной РНК (длиной около 22 нуклеотидов) участвуют в post-transcriptional регулирование через изменения РНК перевода и влияющих на выражение гена2, и выпускаются в обращение в физиологических и патологических государствах. Количественном выражении конкретных интерферирующим могут быть связаны с патологией, и некоторые интерферирующим показать высокий ткани и болезни специфика1. Сердечно-сосудистых заболеваний адаптивной стали привлекательными кандидатами как нового биомаркерами потому, что они чрезвычайно стабильны в сыворотке крови и может легко быть количественно с помощью ПЦР методологии3. Потенциальную ценность интерферирующим качестве биомаркеров для инфаркта миокарда были оценены в небольших исследований, но проверки в большой когорты хватает2. К примеру мир-499 встречается сильно выражена в мышцу миокарда, и было показано, значительно возросла в ами4,5,6. Кроме того, он регулирует запрограммированы гибели клеток (апоптоз) и дифференциация кардиомиоцитов и таким образом участвует в нескольких механизмов после ами7. За исключением некоторых небольших исследований, превосходства и добавочное значение интерферирующим для диагностики ами отчетности превосходства или равенства к высок чувствительности сердечной troponins не еще было доказано в крупномасштабных исследований2,5 6, ,8. Более перспективные исследования в большой когорты таким образом, необходимо оценить потенциальную ценность диагностических адаптивной. Кроме того методы количественной оценки Мирна необходимо оптимизировать и стандартизированных с использованием сопоставимых протоколы9. Стандартизированных анализы могут уменьшить несогласованные результаты и может помочь интерферирующим стать потенциальным биомаркеров для рутинной клинического применения, как биомаркеров должны измеряться в воспроизводимый способом обеспечить их клинического применения.
Недавно dPCR была введена в качестве конечного анализа. Это разбивает образца на приблизительно 20 000 индивидуальных реакций10. DPCR система затем использует математические Пуассона статистический анализ флуоресцентные сигналов (положительных и отрицательных реакций), позволяя абсолютный количественной оценки без стандартной кривой10. При объединении dPCR датчиками флуоресцентные гидролиза, весьма конкретных прямых абсолютной количественная оценка интерферирующим стало возможным. Цифровая полимеразной цепной реакции, как показано, демонстрируют превосходные технические качества (включая снижение изменчивости, увеличение повседневной воспроизводимости, высокая степень линейности и высокой чувствительностью) для количественного определения уровней микроРНК в обращения по сравнению с количественной реальном масштабе времени PCR10,11. Эти превосходные технические качества может помочь смягчить нынешние ограничения на использование циркулирующего интерферирующим в качестве биомаркеров и может привести к созданию интерферирующим биомаркеров в больших Multi-центр сердечно-сосудистой системы клинических испытаний, а также как диагностический метод в Общие. В предыдущем исследовании мы недавно применяется dPCR абсолютной количественного определения циркулирующих интерферирующим у больных с AMI и смогли продемонстрировать превосходное диагностический потенциал, по сравнению с количественной оценки интерферирующим ПЦР12.
В этом издании мы хотим продемонстрировать, что с помощью dPCR точные и воспроизводимые метод непосредственно количественной оценки распространения сердечно-сосудистых адаптивной. Абсолютная количественная оценка Мирна уровней в сыворотке, используя цифровой PCR, показывает потенциал для использования в больших Multi-центр сердечно-сосудистой системы клинических испытаний. В этом издании мы подробно описать, как эффективно выполнять цифровой ПЦР и как определить номер копии абсолютный микроРНК в сыворотке.
Protocol
Representative Results
Discussion
Цифровая ПЦР является относительно новой конечной точки методом ПЦР, что позволяет прямой абсолютной количественной нуклеиновых кислот в рамках выборки. Метод обладает особыми преимуществами, включая снижение изменчивости, увеличение повседневной воспроизводимость и превосходная ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы имеют без подтверждений.
Materials
| RNA-Extraction | |||
| miRNeasy Serum/Plasma Kit (50) | Qiagen-Sample & Assay Technologies, Hilden, Deutschland | 217184 | Kit for microRNA extraction. Kit contains commercial buffer RWT (called number one in the manuscript) and RPE (called number two in manuscript). |
| miRNeasy Serum/Plasma Spike-in-Control; Syn-cel-miR-39 miRNA; 10pmol | Qiagen-Sample & Assay Technologies, Hilden, Deutschland | 219610 | Spike-in for normalisation , Sequence: 5'-UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG-3' |
| Reverse Transcription | |||
| TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit (1000 Reactions) | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4366597 | Kit for microRNA reverse transcription |
| TaqMan MicroRNA Assays M | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4440887 | Assays used in reverse transcription |
| hsa-miR-499 (750 RT/750 PCR rxns) | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4440887 | Assay Number 001352 |
| cel-miR-39 (750 RT/750 PCR rxns) | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4440887 | Assay Number 000200 |
| PCR Plate, 96-well, segmented, semi-skirted | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | AB0900 | 96 well plate for reverse transcription |
| Microseal ‘B’ seal Seals | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | MSB1001 | Foil to ensure proper storage |
| C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1851196 | Cycler used for reverse transcription |
| Droplet Digital PCR | |||
| 100 nmole RNA oligo hsa-miR-499-5p | Integrated DNA Technologies | Custom | Sequence: 5'-phos-UUAAGACUUGCAGUGAUGUUU-3' |
| ddPCR Supermix for Probes (No dUTP) | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863024 | Supermix used in droplet generation |
| TaqMan MicroRNA Assays | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4440887 | Assays used in digital PCR (fluorescent hydrolysis probe) |
| hsa-miR-499 (750 RT/750 PCR rxns) | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4440887 | Assay Number 001352, commercial primers |
| cel-miR-39 (750 RT/750 PCR rxns) | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4440887 | Assay Number 000200, commercial primers |
| DG8 Cartridges and Gaskets | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1864007 | Cartridge takes up to 8 samples for droplet generation |
| DG8 Cartridge Holder | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863051 | Holds cartridges in droplet generation |
| Droplet Generation Oil for Probes | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863005 | Oil used in droplet generation |
| ddPCR 96-Well Plates | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 12001925 | 96 well plate for ddPCR |
| PCR Plate Heat Seal, foil, pierceable | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1814040 | Pierceable foil, compatible with droplet reader |
| ddPCR Droplet Reader Oil | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863004 | Oil used in droplet reading |
| QX100 or QX200 Droplet Generator | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863002 | Droplet Generator, generates the droplets from sample/oil emulsion |
| PX1 PCR Plate Sealer | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1814000 | Seals the plate before PCR |
| C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1851196 | Cycler used for ddPCR |
| QX100 or QX200 Droplet Reader | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863003 | Reads PCR-positive and PCR-negative droplets with an optical detector |
| ddPCR Buffer Control for Probes | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863052 | Blank control and to fill up the remaining wells of 8-well cassette |
| Software | |||
| QuantaSof Software | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1864011 | Program for droplet reading |
| Prism Windows 5 | GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA | Program for statistical analysis |
References
- Schulte, C., Zeller, T. microRNA-based diagnostics and therapy in cardiovascular disease – summing up the facts. Cardiovascular Diagnosis and Therapy. 5, 17-36 (2015).
- Sun, T., et al. The role of microRNAs in myocardial infarction: from molecular mechanism to clinical application. International Journal of Molecular Sciences. 18, (2017).
- Dimmeler, S., Zeiher, A. M. Circulating microRNAs: novel biomarkers for cardiovascular diseases. European Heart Journal. 31, 2705-2707 (2010).
- Creemers, E. E., Tijsen, A. J., Pinto, Y. M. Circulating microRNAs: novel biomarkers and extracellular communicators in cardiovascular disease. Circulation Research. 110, 483-495 (2012).
- Oerlemans, M. I., et al. Early assessment of acute coronary syndromes in the emergency department: the potential diagnostic value of circulating microRNAs. EMBO Molecular Medicine. 4, 1176-1185 (2012).
- Olivieri, F., et al. Diagnostic potential of circulating miR-499-5p in elderly patients with acute non ST-elevation myocardial infarction. Internation Journal of Cardiology. 167, 531-536 (2013).
- Navickas, R., et al. Identifying circulating microRNAs as biomarkers of cardiovascular disease: a systematic review. Cardiovascular Research. 111, 322-337 (2016).
- Devaux, Y., et al. Diagnostic and prognostic value of circulating microRNAs in patients with acute chest pain. Journal of Internal Medicine. 277, 260-271 (2015).
- Schwarzenbach, H., da Silva, A. M., Calin, G., Pantel, K. Data normalization strategies for microRNA quantification. Clinical Chemistry. 61, 1333-1342 (2015).
- Hindson, B. J., et al. High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number. Analytical Chemistry. 83, 8604-8610 (2011).
- Hindson, C. M., et al. Absolute quantification by droplet digital PCR versus analog real-time PCR. Nature Methods. 10, 1003-1005 (2013).
- Robinson, S., et al. Droplet digital PCR as a novel detection method for quantifying microRNAs in acute myocardial infarction. Internation Journal of Cardiology. 257, 247-254 (2018).
- Mitchell, P. S., et al. Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 10513-10518 (2008).
- D’Alessandra, Y., et al. Circulating microRNAs are new and sensitive biomarkers of myocardial infarction. European Heart Journal. 31, 2765-2773 (2010).
- Forootan, A., et al. Methods to determine limit of detection and limit of quantification in quantitative real-time PCR (qPCR). Biomolecular Detection and Quantification. 12, 1-6 (2017).
- Dingle, T. C., Sedlak, R. H., Cook, L., Jerome, K. R. Tolerance of droplet-digital PCR vs real-time quantitative PCR to inhibitory substances. Clinical Chemistry. 59, 1670-1672 (2013).
- Taylor, S. C., Laperriere, G., Germain, H. Droplet digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: from variable nonsense to publication quality data. Scientific Reports. 7, 2409 (2017).
