PCR digital para quantificar circulando MicroRNAs no infarto agudo do miocárdio e doença Cardiovascular
Summary
MicroRNAs circulantes têm mostrado promessa como biomarcadores para doenças cardiovasculares e aguda do miocárdio. Neste estudo, descrevemos um protocolo para extração de miRNA, a transcrição reversa e PCR digital para a quantificação absoluta dos miRNAs no soro de pacientes com doença cardiovascular.
Abstract
Circulação soro microRNAs (miRNAs) mostraram a promessa como biomarcadores para a doença cardiovascular e infarto agudo do miocárdio (iam), sendo liberada a partir das células cardiovasculares para a circulação. Os miRNAs circulantes são altamente estáveis e pode ser quantificados. A expressão quantitativa dos miRNAs específicos pode ser vinculada a patologia e alguns miRNAs mostrar tecido alta e especificidade da doença. Encontrar novos biomarcadores para doenças cardiovasculares é de importância para a pesquisa médica. Muito recentemente, reação em cadeia da polimerase digital (dPCR) foi inventada. dPCR, combinado com sondas fluorescentes de hidrólise, permite uma quantificação absoluta direta específica. dPCR exibe qualidades técnicas superiores, incluindo uma baixa variabilidade, alta linearidade e alta sensibilidade em comparação com a reação em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR). Assim, dPCR é um método mais preciso e reprodutível para quantificar diretamente os miRNAs, particularmente para o uso em grandes multi centro de ensaios clínicos cardiovasculares. Nesta publicação, descrevemos como efetivamente realizar PCR digital a fim de avaliar o número de cópia absoluta em amostras de soro.
Introduction
MiRNAs circulantes foram identificados como marcadores promissoras para uma série de doenças, incluindo doenças cardiovasculares1. Os miRNAs são pequenos, não-codificantes single-stranded RNA moléculas (aproximadamente 22 nucleotides longas) são envolvidas no Regulamento pós-transcricional através da alteração da tradução do RNA mensageiro e influenciando da expressão do gene2, e são liberados na circulação em Estados fisiológicos e patológicos. A expressão quantitativa dos miRNAs específicos pode ser vinculada a patologia, e alguns miRNAs mostram tecido alto e especificidade de doença1. Em doenças cardiovasculares, os miRNAs tornaram-se candidatos atraentes como biomarcadores novela porque são notavelmente estáveis no soro e pode facilmente ser quantificada com a ajuda da metodologia PCR3. O valor potencial dos miRNAs como biomarcadores para infarto do miocárdio foi avaliado em estudos pequenos, mas uma validação em grandes coortes está faltando2. Por exemplo, miR-499 encontra-se altamente expressa no músculo do miocárdio, e isso foi mostrado para aumentar significativamente em um AMI4,5,6. Além disso, regula programada morte celular (apoptose) e a diferenciação dos cardiomyocytes e, portanto, está envolvida em vários mecanismos seguindo um AMI7. Além de alguns pequenos estudos relatando uma superioridade e valor incremental de miRNAs para o diagnóstico da AMI, a superioridade ou igualdade de alta sensibilidade cardíacas troponinas não ainda foi comprovada em estudos em grande escala2,5 ,6,8. Mais estudos prospectivos de coortes grandes são, portanto, necessários para avaliar o valor potencial de diagnóstico dos miRNAs. Além disso, métodos de quantificação de miRNA precisam ser otimizadas e padronizado usando comparáveis protocolos9. Ensaios padronizados podem reduzir resultados inconsistentes e podem ajudar os miRNAs tornar-se potenciais biomarcadores para a aplicação clínica de rotina, como biomarcadores precisam ser quantificado de forma reprodutível para garantir sua aplicabilidade clínica.
Recentemente, dPCR foi introduzido como uma análise de ponto de extremidade. Ele particiona a amostra em aproximadamente 20.000 reações individuais10. O sistema dPCR então utiliza uma matemático Poisson análise estatística de sinais fluorescentes (reações positivas e negativas), permitindo uma quantificação absoluta sem uma curva padrão de10. Ao combinar dPCR com sondas fluorescentes de hidrólise, a quantificação absoluta direta altamente específica de miRNAs é tornada possível. Reação em cadeia da polimerase digital tem demonstrado que exibem qualidades técnicas superiores (incluindo uma diminuição da variabilidade, uma maior reprodutibilidade do dia a dia, um alto grau de linearidade e uma sensibilidade elevada) para quantificação dos níveis de miRNA na circulação comparada a PCR em tempo real quantitativa10,11. Estas qualidades técnicas superiores podem ajudar a atenuar as limitações atuais sobre o uso de miRNAs circulantes como biomarcadores e podem levar ao estabelecimento de miRNAs como biomarcadores em grandes multi centro de ensaios clínicos cardiovasculares e como um método de diagnóstico em geral. Em um estudo anterior, recentemente aplicada dPCR para a quantificação absoluta de miRNAs em pacientes com um AMI em circulação e foram capazes de demonstrar o potencial de diagnóstico superior em comparação com a quantificação dos miRNAs por qPCR12.
Nesta publicação, queremos demonstrar que o uso dPCR é um método exacto e reprodutível para quantificar diretamente a circulação cardiovasculares miRNAs. A quantificação absoluta de miRNA níveis no soro, utilizando PCR digital, mostra o potencial para o uso em grandes multi centro ensaios clínicos cardiovasculares. Nesta publicação, descrevemos em detalhe como efetivamente realizar PCR digital e como detectar o número de cópia de miRNA absoluto, no soro.
Protocol
Representative Results
Discussion
Digital PCR é um método relativamente novo de ponto de extremidade do PCR que permite a quantificação absoluta direta de ácidos nucleicos dentro de uma amostra. O método possui vantagens específicas, incluindo uma diminuição da variabilidade, uma maior reprodutibilidade diária e uma sensibilidade superior11,12. Além disso, devido o particionamento da amostra em aproximadamente 20.000 reações simples e análises de ponto de extremidade, dPCR é mais r…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores têm sem confirmações.
Materials
| RNA-Extraction | |||
| miRNeasy Serum/Plasma Kit (50) | Qiagen-Sample & Assay Technologies, Hilden, Deutschland | 217184 | Kit for microRNA extraction. Kit contains commercial buffer RWT (called number one in the manuscript) and RPE (called number two in manuscript). |
| miRNeasy Serum/Plasma Spike-in-Control; Syn-cel-miR-39 miRNA; 10pmol | Qiagen-Sample & Assay Technologies, Hilden, Deutschland | 219610 | Spike-in for normalisation , Sequence: 5'-UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG-3' |
| Reverse Transcription | |||
| TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit (1000 Reactions) | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4366597 | Kit for microRNA reverse transcription |
| TaqMan MicroRNA Assays M | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4440887 | Assays used in reverse transcription |
| hsa-miR-499 (750 RT/750 PCR rxns) | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4440887 | Assay Number 001352 |
| cel-miR-39 (750 RT/750 PCR rxns) | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4440887 | Assay Number 000200 |
| PCR Plate, 96-well, segmented, semi-skirted | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | AB0900 | 96 well plate for reverse transcription |
| Microseal ‘B’ seal Seals | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | MSB1001 | Foil to ensure proper storage |
| C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1851196 | Cycler used for reverse transcription |
| Droplet Digital PCR | |||
| 100 nmole RNA oligo hsa-miR-499-5p | Integrated DNA Technologies | Custom | Sequence: 5'-phos-UUAAGACUUGCAGUGAUGUUU-3' |
| ddPCR Supermix for Probes (No dUTP) | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863024 | Supermix used in droplet generation |
| TaqMan MicroRNA Assays | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4440887 | Assays used in digital PCR (fluorescent hydrolysis probe) |
| hsa-miR-499 (750 RT/750 PCR rxns) | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4440887 | Assay Number 001352, commercial primers |
| cel-miR-39 (750 RT/750 PCR rxns) | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4440887 | Assay Number 000200, commercial primers |
| DG8 Cartridges and Gaskets | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1864007 | Cartridge takes up to 8 samples for droplet generation |
| DG8 Cartridge Holder | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863051 | Holds cartridges in droplet generation |
| Droplet Generation Oil for Probes | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863005 | Oil used in droplet generation |
| ddPCR 96-Well Plates | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 12001925 | 96 well plate for ddPCR |
| PCR Plate Heat Seal, foil, pierceable | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1814040 | Pierceable foil, compatible with droplet reader |
| ddPCR Droplet Reader Oil | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863004 | Oil used in droplet reading |
| QX100 or QX200 Droplet Generator | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863002 | Droplet Generator, generates the droplets from sample/oil emulsion |
| PX1 PCR Plate Sealer | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1814000 | Seals the plate before PCR |
| C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1851196 | Cycler used for ddPCR |
| QX100 or QX200 Droplet Reader | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863003 | Reads PCR-positive and PCR-negative droplets with an optical detector |
| ddPCR Buffer Control for Probes | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863052 | Blank control and to fill up the remaining wells of 8-well cassette |
| Software | |||
| QuantaSof Software | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1864011 | Program for droplet reading |
| Prism Windows 5 | GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA | Program for statistical analysis |
References
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