PCR numérique pour quantifier les microARN dans l’infarctus aigu du myocarde et les maladies cardiovasculaires en circulation
Summary
Les microARN circulants ont montré prometteur comme biomarqueurs des maladies cardiovasculaires et d’infarctus du myocarde aigus. Dans cette étude, les auteurs décrivent un protocole pour l’extraction de miRNA, transcription inverse et ACP numérique pour la quantification absolue des miARN dans le sérum des patients atteints de maladies cardiovasculaires.
Abstract
Circulants sérum microARN (miARN) ont montré prometteur comme biomarqueurs pour les maladies cardiovasculaires et infarctus aigu du myocarde (IAM), étant libérée des cellules cardiovasculaires dans la circulation. MiARN circulants est très stables et peut être quantifiées. L’expression quantitative des miARN spécifiques peut être liée à la pathologie et certains miARN Voir la haute tissu et la spécificité de la maladie. Trouver de nouveaux biomarqueurs des maladies cardiovasculaires est d’importance pour la recherche médicale. Tout récemment, réaction en chaîne de polymérase numérique (dPCR) a été inventée. dPCR, combiné avec les sondes fluorescentes hydrolyse, permet une quantification absolue directe spécifique. dPCR présente des qualités techniques supérieures, y compris une faible variabilité, une linéarité élevée et une sensibilité élevée par rapport à la réaction en chaîne par polymérase quantitative (qPCR). DPCR est donc une méthode plus précise et reproductible pour quantifier directement les miARN, particulièrement pour l’utilisation lors d’essais cliniques cardiovasculaires de grandes multi-center. Dans cette publication, nous décrivons comment effectuer efficacement numérique PCR afin d’évaluer le nombre de copies absolue dans le sérum.
Introduction
MiARN circulants ont été identifiés comme marqueurs prometteurs pour un certain nombre de maladies, y compris les maladies cardiovasculaires,1. Les miARN est petites, de molécules d’ARN simple brin non codant (environ 22 nucléotides de long) sont impliqués dans la post-transcriptionnelle via la modification de la traduction de l’ARN messager et l’expression de gène influençant2, et sont libérés dans la circulation dans les États physiologiques et pathologiques. L’expression quantitative des miARN spécifique peut être liée à la pathologie, et certains miARN montre tissu haut et spécificité de la maladie1. Dans les maladies cardiovasculaires, miARN est devenus candidats attrayants comme nouveaux biomarqueurs parce qu’ils sont remarquablement stables dans le sérum et peuvent facilement être quantifiées à l’aide de la PCR méthodologie3. La valeur potentielle des miARN comme biomarqueurs pour infarctus du myocarde a été évaluée dans des études de petites envergure, mais une validation dans des cohortes manque2. Par exemple, miR-499 se trouve fortement exprimée dans le muscle myocardique, et il s’est avéré être une augmentation significative chez un AMI4,5,6. En outre, il réglemente programmé la mort cellulaire (apoptose) et la différenciation des cardiomyocytes et participe ainsi à plusieurs mécanismes suivant un AMI7. Mis à part quelques petites études rapports une supériorité et une valeur incrémentielle des miARN pour le diagnostic de l’AMI, la supériorité ou l’égalité à haute sensibilité troponines cardiaques n’a pas encore été prouvée dans des études à grande échelle2,5 ,6,8. Plusieurs études prospectives dans des cohortes sont, par conséquent, nécessaires pour évaluer la valeur diagnostique potentielle des miARN. En outre, méthodes de quantification de miRNA doivent être optimisées et9des protocoles normalisés utilisant comparables. Essais normalisés peuvent réduire des résultats incohérents et peuvent aider les miARN pour devenir des biomarqueurs potentiels pour l’application clinique de routine, comme biomarqueurs doivent être quantifiés de manière reproductible pour assurer leur application clinique.
Récemment, dPCR a été présenté comme une analyse de point final. Il répartit l’échantillon dans environ 20 000 réactions individuelles10. Le système dPCR utilise ensuite une Poisson statistique analyse mathématique des signaux fluorescents (réactions positives et négatives), ce qui permet une quantification absolue sans une courbe standard10. Pour combiner dPCR avec sondes fluorescentes hydrolyse, la quantification absolue directe hautement spécifique des miARN est rendue possible. Réaction en chaîne de polymérase numérique a démontré que présentent des qualités techniques supérieures (y compris une variabilité réduite, une reproductibilité quotidienne accrue, un haut degré de linéarité et une sensibilité élevée) pour quantifier les niveaux de miRNA dans le circulation par rapport à quantitative en temps réel PCR10,11. Ces qualités techniques supérieures pourraient aider à atténuer les limites en vigueur sur l’utilisation des miARN circulant comme biomarqueurs et pourraient mener à l’établissement des miARN comme biomarqueurs dans grands multi-centres les essais cliniques cardiovasculaires et comme une méthode de diagnostic en en général. Dans une étude précédente, nous avons récemment appliqué dPCR pour la quantification absolue des miARN chez les patients avec une AMI en circulation et ont pu démontrer le potentiel de diagnostique supérieure par rapport à la quantification des miARN de qPCR12.
Dans cette publication, nous voulons démontrer que l’utilisation dPCR est une méthode précise et reproductible pour quantifier directement miARN cardiovasculaire en circulation. La quantification absolue de miRNA niveaux dans le sérum par PCR digital, montre potentielle pour l’utilisation lors d’essais cliniques cardiovasculaires de grandes multi-center. Dans cette publication, nous décrivons en détail comment effectuer efficacement PCR numérique et comment détecter le nombre de copies de miRNA absolue dans le sérum.
Protocol
Representative Results
Discussion
PCR numérique est une méthode relativement nouvelle butée de PCR qui permet la quantification absolue directe d’acides nucléiques dans un échantillon. La méthode possède des avantages particuliers, notamment une diminution de la variabilité, une reproductibilité quotidienne accrue et une sensibilité supérieure11,12. En outre, en raison de la répartition de l’échantillon dans environ 20 000 réactions simples et des analyses de point de terminaiso…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs n’ont aucuns accusés de réception.
Materials
| RNA-Extraction | |||
| miRNeasy Serum/Plasma Kit (50) | Qiagen-Sample & Assay Technologies, Hilden, Deutschland | 217184 | Kit for microRNA extraction. Kit contains commercial buffer RWT (called number one in the manuscript) and RPE (called number two in manuscript). |
| miRNeasy Serum/Plasma Spike-in-Control; Syn-cel-miR-39 miRNA; 10pmol | Qiagen-Sample & Assay Technologies, Hilden, Deutschland | 219610 | Spike-in for normalisation , Sequence: 5'-UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG-3' |
| Reverse Transcription | |||
| TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit (1000 Reactions) | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4366597 | Kit for microRNA reverse transcription |
| TaqMan MicroRNA Assays M | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4440887 | Assays used in reverse transcription |
| hsa-miR-499 (750 RT/750 PCR rxns) | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4440887 | Assay Number 001352 |
| cel-miR-39 (750 RT/750 PCR rxns) | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4440887 | Assay Number 000200 |
| PCR Plate, 96-well, segmented, semi-skirted | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | AB0900 | 96 well plate for reverse transcription |
| Microseal ‘B’ seal Seals | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | MSB1001 | Foil to ensure proper storage |
| C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1851196 | Cycler used for reverse transcription |
| Droplet Digital PCR | |||
| 100 nmole RNA oligo hsa-miR-499-5p | Integrated DNA Technologies | Custom | Sequence: 5'-phos-UUAAGACUUGCAGUGAUGUUU-3' |
| ddPCR Supermix for Probes (No dUTP) | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863024 | Supermix used in droplet generation |
| TaqMan MicroRNA Assays | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4440887 | Assays used in digital PCR (fluorescent hydrolysis probe) |
| hsa-miR-499 (750 RT/750 PCR rxns) | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4440887 | Assay Number 001352, commercial primers |
| cel-miR-39 (750 RT/750 PCR rxns) | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4440887 | Assay Number 000200, commercial primers |
| DG8 Cartridges and Gaskets | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1864007 | Cartridge takes up to 8 samples for droplet generation |
| DG8 Cartridge Holder | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863051 | Holds cartridges in droplet generation |
| Droplet Generation Oil for Probes | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863005 | Oil used in droplet generation |
| ddPCR 96-Well Plates | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 12001925 | 96 well plate for ddPCR |
| PCR Plate Heat Seal, foil, pierceable | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1814040 | Pierceable foil, compatible with droplet reader |
| ddPCR Droplet Reader Oil | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863004 | Oil used in droplet reading |
| QX100 or QX200 Droplet Generator | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863002 | Droplet Generator, generates the droplets from sample/oil emulsion |
| PX1 PCR Plate Sealer | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1814000 | Seals the plate before PCR |
| C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1851196 | Cycler used for ddPCR |
| QX100 or QX200 Droplet Reader | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863003 | Reads PCR-positive and PCR-negative droplets with an optical detector |
| ddPCR Buffer Control for Probes | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863052 | Blank control and to fill up the remaining wells of 8-well cassette |
| Software | |||
| QuantaSof Software | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1864011 | Program for droplet reading |
| Prism Windows 5 | GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA | Program for statistical analysis |
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