Akut miyokard infarktüsü ve kardiyovasküler hastalık mikroRNA'lar dolaşan miktarının için dijital PCR
Summary
Dolaşımdaki mikroRNA’lar söz biyolojik kalp-damar hastalıkları ve akut miyokard enfarktüsü olarak göstermiştir. Bu çalışmada, bir protokol miRNA ayıklama, Ters transkripsiyon ve kardiyovasküler hastalığı olan hastalarda serum miRNAs mutlak miktar için dijital PCR için açıklar.
Abstract
Dolaşımdaki serum mikroRNA (miRNAs) kalp-damar hastalıkları ve akut miyokard infarktüsü (AMI), biyolojik olarak kardiyovasküler hücrelerden dolaşıma serbest bırakılması söz göstermiştir. Dolaşımdaki miRNAs son derece istikrarlı ve sayısal. Belirli miRNAs nicel ifade patoloji ve bazı miRNAs gösteri yüksek doku ve hastalık özgüllük bağlanabilir. Roman biyolojik kalp-damar hastalıkları için bulma tıbbi araştırma için önem taşıyor. Oldukça yakın, dijital polimeraz zincir reaksiyonu (dPCR) icat etti. dPCR, floresan hidroliz probları ile birlikte belirli doğrudan mutlak miktar sağlar. dPCR düşük değişkenliği, yüksek doğrusallık ve nicel polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) göre yüksek hassasiyet gibi üstün teknik nitelikleri sergiler. Böylece, dPCR doğrudan miRNAs, özellikle büyük çok merkezi kardiyovasküler klinik çalışmalarda kullanılmak miktarının bir daha doğru ve tekrarlanabilir yöntemdir. Bu yayında nasıl etkili serum numuneleri mutlak kopya sayısında değerlendirmek için dijital PCR gerçekleştirmek açıklar.
Introduction
Dolaşımdaki miRNAs hastalıkları, kardiyovasküler hastalık1de dahil olmak üzere bir dizi için umut verici işaretler olarak tespit edilmiştir. MiRNAs küçük, kodlama-tek iplikçikli RNA molekülleri (yaklaşık 22 nükleotit uzun) söz konusu olursa çoğu düzenleme yoluyla değişiklik mesajcı RNA çeviri ve etkileyen gen ifade2, içinde ve içine fizyolojik ve patolojik durumları dolaşımda serbest bırakılır. Belirli miRNAs nicel ifade patolojiye bağlanabilir ve yüksek doku ve hastalık özgüllük1bazı miRNAs göstermektedir. Kardiyovasküler hastalıklarda miRNAs onlar serum içinde son derece kararlı olduğu ve kolayca yeni biyolojik PCR metodoloji3yardımı ile sayısal gibi çekici aday olmuştur. Miyokard infarktüsünde biyolojik olarak miRNAs potansiyel değeri küçük çalışmalarda değerlendirilmiştir ama büyük tabur bir doğrulama2eksik. Örneğin, miR-499 son derece miyokardiyal kas ifade bulunur ve bir amı4,5,6‘ önemli ölçüde artış gösterilmiştir. Ayrıca, düzenleyen programlanmış hücre ölümü (apoptoz) ve cardiomyocytes farklılaşma ve böylece bir amı7takip çeşitli mekanizmalar ilgilenmektedir. Bir üstünlük ve miRNAs AMI tanısı için artımlı değerini raporlama bazı küçük çalışmalar dışında üstünlük veya eşitlik yüksek-duyarlı kardiyak troponins için henüz büyük ölçekli çalışmalar2‘,5 kanıtlanmamıştır ,6,8. Bu nedenle, ileriye dönük çalışmalarda daha büyük tabur miRNAs olası tanı değerini değerlendirmek için gereklidir. Ayrıca, miRNA miktar yöntemleri optimize edilmiş olması gerekir ve standart karşılaştırılabilir kullanarak9protokolleri. Standart deneyleri tutarsız sonuçlar azaltabilir ve biyolojik kendi klinik uygulanabilirliği sağlamak için tekrarlanabilir bir şekilde sayısal gerek rutin klinik uygulama için potansiyel biyolojik olmak için miRNAs yardımcı olabilir.
Son zamanlarda, dPCR bir son nokta analiz olarak tanıttı. Yaklaşık 20.000 bireysel tepkiler10örnek bölümleri. DPCR sistemi standart eğri10olmadan mutlak bir miktar etkinleştirme bir matematiksel Poisson istatistiksel analiz floresan sinyallerini (pozitif ve negatif tepkiler), sonra kullanır. DPCR floresan hidroliz probları ile birleştirilirken, miRNAs çok özel doğrudan mutlak miktar mümkün olmaktadır. Dijital polimeraz zincir reaksiyonu miRNA seviyelerinde miktarının için (azalan bir değişkenliği, artan bir gün-gün tekrarlanabilirlik, doğrusallık yüksek derecede ve yüksek bir hassasiyet de dahil olmak üzere) üstün teknik özellikleri sergilemek göstermiştir nicel gerçek zamanlı PCR10,11‘ e göre dolaşım. Bu üstün teknik nitelikleri dolaşımdaki miRNAs biyolojik kullanma mevcut kısıtlamaları hafifletmek için yardımcı olabilir ve miRNAs kurulması için biyolojik büyük çok merkezi kardiyovasküler klinik çalışmalarda ve bir tanı yöntemi olarak neden olabilir Genel. Bir önceki çalışmada son zamanlarda dPCR miRNAs bir AMI hastalarında dolaşımdaki mutlak miktar için uygulanan ve miRNAs miktar için qPCR12ile karşılaştırıldığında üstün tanılama potansiyel göstermek başardık.
Bu yayında, dPCR kullanarak doğrudan kardiyovasküler miRNAs dolaşan miktarının için doğru ve tekrarlanabilir bir yöntem olduğunu ispat etmek istiyoruz. MiRNA düzeyleri kullanarak dijital PCR, serumda mutlak miktar büyük çok merkezi kardiyovasküler klinik deneylere kullanım için potansiyel gösterir. Bu yayında, etkili bir şekilde dijital PCR gerçekleştirmek ve serum içinde mutlak miRNA kopya numarası tespit ayrıntılı olarak anlatan.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dijital PCR nükleik asitler bir örnek içinde doğrudan mutlak miktar sağlar PCR nispeten roman son nokta yöntemidir. Yöntemi belirli avantajları, azalan bir değişkenliği, artan bir gün-gün tekrarlanabilirlik ve üstün hassasiyet11,12de dahil olmak üzere sahiptir. Ayrıca, örnek yaklaşık 20.000 tek reaksiyonlar ve bitiş noktası analizleri bölümleme nedeniyle, dPCR için daha sağlam olur kantitatif RT-PCR16için karşı…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar hiçbir ilgili kaynaklar var.
Materials
| RNA-Extraction | |||
| miRNeasy Serum/Plasma Kit (50) | Qiagen-Sample & Assay Technologies, Hilden, Deutschland | 217184 | Kit for microRNA extraction. Kit contains commercial buffer RWT (called number one in the manuscript) and RPE (called number two in manuscript). |
| miRNeasy Serum/Plasma Spike-in-Control; Syn-cel-miR-39 miRNA; 10pmol | Qiagen-Sample & Assay Technologies, Hilden, Deutschland | 219610 | Spike-in for normalisation , Sequence: 5'-UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG-3' |
| Reverse Transcription | |||
| TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit (1000 Reactions) | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4366597 | Kit for microRNA reverse transcription |
| TaqMan MicroRNA Assays M | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4440887 | Assays used in reverse transcription |
| hsa-miR-499 (750 RT/750 PCR rxns) | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4440887 | Assay Number 001352 |
| cel-miR-39 (750 RT/750 PCR rxns) | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4440887 | Assay Number 000200 |
| PCR Plate, 96-well, segmented, semi-skirted | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | AB0900 | 96 well plate for reverse transcription |
| Microseal ‘B’ seal Seals | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | MSB1001 | Foil to ensure proper storage |
| C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1851196 | Cycler used for reverse transcription |
| Droplet Digital PCR | |||
| 100 nmole RNA oligo hsa-miR-499-5p | Integrated DNA Technologies | Custom | Sequence: 5'-phos-UUAAGACUUGCAGUGAUGUUU-3' |
| ddPCR Supermix for Probes (No dUTP) | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863024 | Supermix used in droplet generation |
| TaqMan MicroRNA Assays | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4440887 | Assays used in digital PCR (fluorescent hydrolysis probe) |
| hsa-miR-499 (750 RT/750 PCR rxns) | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4440887 | Assay Number 001352, commercial primers |
| cel-miR-39 (750 RT/750 PCR rxns) | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4440887 | Assay Number 000200, commercial primers |
| DG8 Cartridges and Gaskets | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1864007 | Cartridge takes up to 8 samples for droplet generation |
| DG8 Cartridge Holder | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863051 | Holds cartridges in droplet generation |
| Droplet Generation Oil for Probes | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863005 | Oil used in droplet generation |
| ddPCR 96-Well Plates | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 12001925 | 96 well plate for ddPCR |
| PCR Plate Heat Seal, foil, pierceable | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1814040 | Pierceable foil, compatible with droplet reader |
| ddPCR Droplet Reader Oil | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863004 | Oil used in droplet reading |
| QX100 or QX200 Droplet Generator | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863002 | Droplet Generator, generates the droplets from sample/oil emulsion |
| PX1 PCR Plate Sealer | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1814000 | Seals the plate before PCR |
| C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1851196 | Cycler used for ddPCR |
| QX100 or QX200 Droplet Reader | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863003 | Reads PCR-positive and PCR-negative droplets with an optical detector |
| ddPCR Buffer Control for Probes | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863052 | Blank control and to fill up the remaining wells of 8-well cassette |
| Software | |||
| QuantaSof Software | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1864011 | Program for droplet reading |
| Prism Windows 5 | GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA | Program for statistical analysis |
References
- Schulte, C., Zeller, T. microRNA-based diagnostics and therapy in cardiovascular disease – summing up the facts. Cardiovascular Diagnosis and Therapy. 5, 17-36 (2015).
- Sun, T., et al. The role of microRNAs in myocardial infarction: from molecular mechanism to clinical application. International Journal of Molecular Sciences. 18, (2017).
- Dimmeler, S., Zeiher, A. M. Circulating microRNAs: novel biomarkers for cardiovascular diseases. European Heart Journal. 31, 2705-2707 (2010).
- Creemers, E. E., Tijsen, A. J., Pinto, Y. M. Circulating microRNAs: novel biomarkers and extracellular communicators in cardiovascular disease. Circulation Research. 110, 483-495 (2012).
- Oerlemans, M. I., et al. Early assessment of acute coronary syndromes in the emergency department: the potential diagnostic value of circulating microRNAs. EMBO Molecular Medicine. 4, 1176-1185 (2012).
- Olivieri, F., et al. Diagnostic potential of circulating miR-499-5p in elderly patients with acute non ST-elevation myocardial infarction. Internation Journal of Cardiology. 167, 531-536 (2013).
- Navickas, R., et al. Identifying circulating microRNAs as biomarkers of cardiovascular disease: a systematic review. Cardiovascular Research. 111, 322-337 (2016).
- Devaux, Y., et al. Diagnostic and prognostic value of circulating microRNAs in patients with acute chest pain. Journal of Internal Medicine. 277, 260-271 (2015).
- Schwarzenbach, H., da Silva, A. M., Calin, G., Pantel, K. Data normalization strategies for microRNA quantification. Clinical Chemistry. 61, 1333-1342 (2015).
- Hindson, B. J., et al. High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number. Analytical Chemistry. 83, 8604-8610 (2011).
- Hindson, C. M., et al. Absolute quantification by droplet digital PCR versus analog real-time PCR. Nature Methods. 10, 1003-1005 (2013).
- Robinson, S., et al. Droplet digital PCR as a novel detection method for quantifying microRNAs in acute myocardial infarction. Internation Journal of Cardiology. 257, 247-254 (2018).
- Mitchell, P. S., et al. Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 10513-10518 (2008).
- D’Alessandra, Y., et al. Circulating microRNAs are new and sensitive biomarkers of myocardial infarction. European Heart Journal. 31, 2765-2773 (2010).
- Forootan, A., et al. Methods to determine limit of detection and limit of quantification in quantitative real-time PCR (qPCR). Biomolecular Detection and Quantification. 12, 1-6 (2017).
- Dingle, T. C., Sedlak, R. H., Cook, L., Jerome, K. R. Tolerance of droplet-digital PCR vs real-time quantitative PCR to inhibitory substances. Clinical Chemistry. 59, 1670-1672 (2013).
- Taylor, S. C., Laperriere, G., Germain, H. Droplet digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: from variable nonsense to publication quality data. Scientific Reports. 7, 2409 (2017).
