Funktionel evaluering af olfaktoriske veje i levende Xenopus haletudser
Summary
Xenopus haletudser tilbyder en unik platform for at undersøge funktionen af nervesystemet in vivo. Vi beskriver metoder til at vurdere behandling af olfaktoriske oplysninger i levende Xenopus larver paa normale opdræt eller efter skade.
Abstract
Xenopus haletudser tilbyder en unik platform for at undersøge funktionen af nervesystemet. De giver flere eksperimentelle fordele, såsom adgang til talrige imaging tilgange, elektrofysiologiske teknikker og adfærdsmæssige assays. Xenopus haletudse olfaktoriske system er særlig velegnet til at undersøge funktionen af synapser etableret under normale udvikling eller reformeret efter skade. Her, vi beskriver metoder til at vurdere behandling af olfaktoriske oplysninger i levende Xenopus larver. Vi skitsere en kombination af in vivo målinger af præsynaptiske calcium svar i glomeruli af olfaktoriske pære med olfaktoriske-styrede adfærd assays. Metoder kan kombineres med transection af olfaktoriske nerver at studere rewiring af synaptisk forbindelse. Eksperimenter er præsenteret ved hjælp af både vilde-typen og genetisk modificerede dyr udtryk for normal god landbrugspraksis journalister i centralnervesystemet celler. Anvendelsen af metoderne til genetisk modificerede haletudser beskrevne kan være nyttige for optrævler det molekylære grundlag, der definerer hvirveldyr adfærd.
Introduction
Xenopus haletudser udgør en fremragende dyremodel for at studere den normale funktion af nervesystemet. Gennemsigtighed, fuldt sekventeret genom1,2og tilgængelighed til kirurgisk, elektrofysiologiske og Billeddannende teknikker er unikke egenskaber af Xenopus larver, der giver mulighed for at undersøge neuronal funktioner in vivo3 . Nogle af flere eksperimentelle mulighederne for dette dyr model er illustreret ved de grundige undersøgelser udført på haletudse sensoriske og motoriske systemer4,5,6. En særlig velegnet neuronal kredsløb til at studere mange aspekter af informationsbehandling på niveauet af synapser er Xenopus haletudse olfaktoriske system7. For det første, dens synaptisk forbindelse er veldefineret: olfaktoriske receptor neuroner (ORNs) projekt til olfaktoriske pære og etablere synaptic kontakter med dendritter af mitral/tuftet celler i glomeruli at generere lugt kort. For det andet genereres dens ORNs kontinuerligt af neurogenese hele livet at opretholde funktionaliteten af olfaktoriske veje8. Og for det tredje fordi det olfaktoriske system viser en stor regenerative evne, Xenopus haletudser er købedygtig helt reformere deres lugtekolben efter ablation9.
I dette papir beskriver vi tilgange, der kombinerer billeddannelse af olfaktoriske glomeruli i levende haletudser med adfærdsmæssige eksperimenter til at studere funktionaliteten af olfaktoriske veje. Metoderne detaljeret her blev brugt til at studere den funktionelle genopretning af glomerulær connectivity i de olfaktoriske pære efter lugtenerven transection10. Oplysninger indhentet i Xenopus haletudser er repræsentant for hvirveldyr da olfaktoriske forarbejdning er evolutionær bevares.
De beskrevne metoder er eksemplificeret ved hjælp af X. tropicalis , men de kan nemt implementeres i X. Bærmispel. Trods den større størrelse af voksen X. laeviser begge arter bemærkelsesværdigt ens haletudse gennemførelsesstadier. De væsentligste forskelle findes på genomisk niveau. X. laevis viser dårlig genetiske sporbarhed, overvejende bestemt af sin allotetraploid genom og lange generationstid (ca 1 år). Derimod er X. tropicalis mere modtagelig for genetiske modifikationer på grund af dens kortere generationstid (5-8 måneder) og diploide genom. De repræsentative eksperimenter er illustreret for wild-type dyr og tre forskellige transgene linjer: Hb9:GFP (X. tropicalis), NBT:GFP (X. tropicalis) og tubb2:GFP (X. laevis).
De metoder, der er skitseret i det nuværende arbejde bør overvejes sammen med de genetiske skrider frem i feltet Xenopus . Enkelhed og nem implementering af de teknikker præsenteret gør dem særligt nyttigt for evaluering allerede beskrevet mutanter11, samt Xenopus linjer genereret af CRISPR-Cas9 teknologi12. Vi også beskrive en kirurgisk procedure, der anvendes til Transekttællinger olfaktoriske nerver, der kan gennemføres i et laboratorium, der har adgang til Xenopus haletudser. Metoderne anvendes for at vurdere præsynaptiske calcium svar og olfaktoriske-styrede adfærd kræver specifikke udstyr, omend på en moderat omkostninger. Metoder er præsenteret i en simpel formular til at fremme deres anvendelse i forskningsgrupper og kunne angive grundlaget for mere komplekse assays, enten ved at gennemføre forbedringer eller ved association til andre teknikker, dvs, histologiske eller genetiske metoder.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dette papir beskriver teknikker, der er nyttige til at undersøge funktionaliteten af olfaktoriske veje i levende Xenopus haletudser. Den nuværende protokol er især nyttigt for de laboratorier, der arbejder, eller har adgang til Xenopus; Det er imidlertid også interessante for de forskere, der studerer det cellulære og molekylære grundlag af neuronal regenerering og reparation. Resultaterne fra Xenopus kan kombineres med data indsamlet i andre hvirveldyr modeller til at identificere bevare…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra El Ministerio de Economía y Competitividad (MINECO; SAF2015-63568-R) destruktionsbestemmelser af den europæiske fond for Regionaludvikling (EFRU), af konkurrencedygtige forskning priser fra M. G. F. Fuortes Memorial Fellowship, Stephen W. Kuffler Fellowship fond, Laura og Arthur Colwin begavet sommer Research Fellowship Fund , Fischbach stipendium, og den store Generation fond af den Marine biologiske laboratorium og den nationale Xenopus ressource RRID:SCR_013731 (Woods Hole, MA) hvor en del af dette arbejde blev udført. Vi takker også CERCA Program / Generalitat de Catalunya til institutionel støtte. A.L. er en Serra Húnter fyr.
Materials
| Salts for aquariums (Instant Ocean Salt) | Tecniplast | XPSIO25R | |
| Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| Tweezers #5 (tip 0.025 x 0.005 mm) | World Precision Instruments | 501985 | |
| Vannas Scissors (tip 0.015 x 0.015) | World Precision Instruments | 501778 | |
| Whatman qualitative filter paper | Fisher Scientific | WH3030917 | |
| X. laevis tubb2-GFP | National Xenopus Resource (NXR), RRID:SCR_013731 | NXR_0.0035 | |
| X.tropicalis NBT-GFP | European Xenopus Resource Center (EXRC) RRID:SCR_007164 | ||
| CellTracker CM-DiI | ThermoFisher Scientific | C-7001 | |
| Calcium Green dextran, Potassium Salt, 10,000 MW, Anionic | ThermoFisher Scientific | C-3713 | |
| Borosilicate capillaries for microinjection | Sutter Instrument | B100-75-10 | O.D.=1.0 mm., I.D.=0.75 mm. |
| Puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| Microinjector | Parker Instruments | Picospritzer III | |
| Sylgard-184 | Sigma-Aldrich | 761028-5EA | |
| Microfil micropipettes | World Precision Instruments | MF28G-5 | |
| Upright microscope | Zeiss | AxioImager-A1 | |
| Master-8 stimulator | A.M.P.I. | ||
| CCD Camera | Hamamatsu | Image EM | |
| Solenoid valves | Warner Instruments | VC-6 Six Channel system | |
| Dow Corning High Vacuum Grease | VWR Scientific | 636082B | |
| Tubocurarine hydrochloride | Sigma-Aldrich | T2379 | |
| CCD Camera | Zeiss | MRC-5 Camera | Controlled by Zen software |
| camera lens | Thorlabs | MVL8ML3 | There are multiple possibilities that should be adapted to the camera model used |
| Epoxy resin | RS Components | ||
| Manifold | Warner Instruments | MP-6 perfusion manifold | |
| Micromanipulator for local delivery of solutions | Narishige | MN-153 | |
| Mini magnetic clamps | Warner Instruments | MAG-7, MAG-6 | |
| Polyethylene tubing | Warner Instruments | 64-0755 | O.D.=1.57 mm., I.D.=1.14 mm. |
References
- Hellsten, U., et al. The genome of the Western clawed frog Xenopus tropicalis. Science. 328 (5978), 633-636 (2010).
- Session, A. M., et al. Genome evolution in the allotetraploid frog Xenopus laevis. Nature. 538 (7625), 336-343 (2016).
- Zhang, L. I., Tao, H. W., Holt, C. E., Harris, W. A., Poo, M. A critical window for cooperation and competition among developing retinotectal synapses. Nature. 395 (6697), 37-44 (1998).
- Li, J., Erisir, A., Cline, H. In vivo time-lapse imaging and serial section electron microscopy reveal developmental synaptic rearrangements. Neuron. 69 (2), 273-286 (2011).
- Dietrich, H., Glasauer, S., Straka, H. Functional Organization of Vestibulo-Ocular Responses in Abducens Motoneurons. Journal of Neuroscience. 37 (15), 4032-4045 (2017).
- Buhl, E., Roberts, A., Soffe, S. R. The role of a trigeminal sensory nucleus in the initiation of locomotion. Journal of Physiology. 590, 2453-2469 (2012).
- Junek, S., Kludt, E., Wolf, F., Schild, D. Olfactory coding with patterns of response latencies. Neuron. 67 (5), 872-884 (2010).
- Stout, R. P., Graziadei, P. P. Influence of the olfactory placode on the development of the brain in Xenopus laevis (Daudin). I. Axonal growth and connections of the transplanted olfactory placode. Neuroscience. 5 (12), 2175-2186 (1980).
- Yoshino, J., Tochinai, S. Functional regeneration of the olfactory bulb requires reconnection to the olfactory nerve in Xenopus larvae. Development, Growth & Differentiation. 48 (1), 15-24 (2006).
- Terni, B., Pacciolla, P., Masanas, H., Gorostiza, P., Llobet, A. Tight temporal coupling between synaptic rewiring of olfactory glomeruli and the emergence of odor-guided behavior in Xenopus tadpoles. Journal of Comparative Neurology. 525 (17), 3769-3783 (2017).
- Goda, T., et al. Genetic screens for mutations affecting development of Xenopus tropicalis. PLOS Genetics. 2 (6), 91 (2006).
- Nakayama, T., et al. Simple and efficient CRISPR/Cas9-mediated targeted mutagenesis in Xenopus tropicalis. Genesis. 51 (12), 835-843 (2013).
- Jafkins, A., Abu-Daya, A., Noble, A., Zimmerman, L. B., Guille, M. Husbandry of Xenopus tropicalis. Methods in Molecular Biology. 917, 17-31 (2012).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. . Early Development of Xenopus laevis. A Laboratory manual. , (2000).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J. . Normal table of Xenopus laevis (Daudin). A systematical and chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis. , (1956).
- Xu, H., Dude, C. M., Baker, C. V. Fine-grained fate maps for the ophthalmic and maxillomandibular trigeminal placodes in the chick embryo. Developmental Biology. 317 (1), 174-186 (2008).
- Friedrich, R. W., Korsching, S. I. Combinatorial and chemotopic odorant coding in the zebrafish olfactory bulb visualized by optical imaging. Neuron. 18 (5), 737-752 (1997).
- Ishibashi, S., Cliffe, R., Amaya, E. Highly efficient bi-allelic mutation rates using TALENs in Xenopus tropicalis. Biology Open. 1 (12), 1273-1276 (2012).
- Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Methods for cell and particle tracking. Methods in Enzymology. 504, 183-200 (2012).
- Nussbaum-Krammer, C. I., Neto, M. F., Brielmann, R. M., Pedersen, J. S., Morimoto, R. I. Investigating the spreading and toxicity of prion-like proteins using the metazoan model organism C. elegans. Journalof Visualized Experiments. (95), e52321 (2015).
- Koide, T., et al. Olfactory neural circuitry for attraction to amino acids revealed by transposon-mediated gene trap approach in zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (24), 9884-9889 (2009).
- Love, N. R., et al. pTransgenesis: a cross-species, modular transgenesis resource. Development. 138 (24), 5451-5458 (2011).
- Tandon, P., Conlon, F., Furlow, J. D., Horb, M. E. Expanding the genetic toolkit in Xenopus: Approaches and opportunities for human disease modeling. Developmental Biology. 426 (2), 325-335 (2017).
- Pratt, K. G., Khakhalin, A. S. Modeling human neurodevelopmental disorders in the Xenopus tadpole: from mechanisms to therapeutic targets. Disease Models & Mechanisms. 6 (5), 1057-1065 (2013).
- Truszkowski, T. L., et al. Fragile X mental retardation protein knockdown in the developing Xenopus tadpole optic tectum results in enhanced feedforward inhibition and behavioral deficits. Neural Development. 11 (1), 14 (2016).
- Hassenklöver, T., Manzini, I. Olfactory wiring logic in amphibians challenges the basic assumptions of the unbranched axon concept. Journal of Neuroscience. 33 (44), 17247-17252 (2013).
- Haas, K., Sin, W. C., Javaherian, A., Li, Z., Cline, H. T. Single-cell electroporation for gene transfer in vivo. Neuron. 29 (3), 583-591 (2001).
- Sild, M., Van Horn, M. R., Schohl, A., Jia, D., Ruthazer, E. S. Neural Activity-Dependent Regulation of Radial Glial Filopodial Motility Is Mediated by Glial cGMP-Dependent Protein Kinase 1 and Contributes to Synapse Maturation in the Developing Visual System. Journal of Neuroscience. 36 (19), 5279-5288 (2016).
- McDiarmid, R., Altig, R. . Tadpoles: The biology of anuran larvae. , 149-169 (1999).
- Heerema, J. L., et al. Behavioral and molecular analyses of olfaction-mediated avoidance responses of Rana (Lithobates) catesbeiana tadpoles: Sensitivity to thyroid hormones, estrogen, and treated municipal wastewater effluent. Hormones and Behavior. 101, 85-93 (2018).
- Gaudin, A., Gascuel, J. 3D atlas describing the ontogenic evolution of the primary olfactory projections in the olfactory bulb of Xenopus laevis. Journal of Comparative Neurology. 489 (4), 403-424 (2005).
- Scheidweiler, U., Nezlin, L., Rabba, J., Müller, B., Schild, D. Slice culture of the olfactory bulb of Xenopus laevis tadpoles. Chemical Senses. 26 (4), 399-407 (2001).
- Manzini, I., Schild, D. Classes and narrowing selectivity of olfactory receptor neurons of Xenopus laevis tadpoles. Journal of General Physiology. 123 (2), 99-107 (2004).
- Kludt, E., Okom, C., Brinkmann, A., Schild, D. Integrating temperature with odor processing in the olfactory bulb. Journal of Neuroscience. 35 (20), 7892-7902 (2015).
