생활 Xenopus Tadpoles에 후 각 통로의 기능 평가
Summary
Xenopus tadpoles vivo에서 신경 시스템의 기능을 조사 하기 위해 독특한 플랫폼을 제공 합니다. 우리 생활에서 후 각 정보 처리를 평가 하는 방법론을 설명 Xenopus 애벌레 정상적인 양육 조건에서 또는 부상 후.
Abstract
Xenopus tadpoles 신경 시스템의 기능을 조사 하기 위해 독특한 플랫폼을 제공 합니다. 그들은 수많은 이미징 접근, electrophysiological 기법과 행동 분석에 대 한 접근 등 여러 실험 장점을 제공합니다. Xenopus 올챙이 후 각 시스템은 정상적인 개발 동안 또는 부상 후 개혁 시 냅 스의 기능을 조사 하는 특히 적합 합니다. 여기, 우리 생활에서 후 각 정보 처리를 평가 하는 방법론을 설명 Xenopus 애벌레. 우리는 후 각 기반 동작 분석으로 후 각 전구의 glomeruli에 연 접 칼슘 반응의 vivo에서 측량의 조합 개요. 메서드 후 각 신경 시 냅 스 연결의 rewiring 공부 transection 결합 될 수 있다. 실험은 중앙 신 경계 세포에서 GFP 기자 표현 야생-타입 및 유전자 변형 동물을 사용 하 여 표시 됩니다. 유전자 변형된 tadpoles를 설명 하는 방식의 응용 분자 기초 척추 동작을 정의 하는 분열에 대 한 유용할 수 있습니다.
Introduction
Xenopus tadpoles 신경 시스템의 정상적인 기능을 공부 하는 우수한 동물 모델을 구성 합니다. 투명성, 완전히 시퀀스 게놈1,2, 그리고 수술, electrophysiological 및 이미징 기법에 대 한 접근은 신경 기능 vivo에서3 조사 허용 Xenopus 애벌레의 독특한 속성 . 이 동물 모델의 여러 실험 가능성의 일부 올챙이 감각 및 모터 시스템4,,56에 수행 하는 철저 한 연구에 의해 설명 됩니다. 정보 처리 시 냅 스 수준에서의 여러 측면을 연구 하는 특히 적합된 신경 회로 Xenopus 올챙이 후 각 시스템7입니다. 첫째, 그것의 시 냅 스 연결은 잘 정의 된: 후 각 수용 체 신경 (ORNs) 후 각 전구에 프로젝트 및 냄새 지도 생성 하기 위해 glomeruli 내의 셀 mitral/술의 dendrites와 시 냅 스 연락처 설정. 둘째, 그것의 ORNs 후 각 경로8의 기능을 유지 하기 위해 전 생애에 걸쳐 신생에 의해 지속적으로 생성 됩니다. 그리고 셋째, 때문에 후 각 시스템 훌륭한 재생 능력을 보여줍니다, Xenopus tadpoles 수 있습니다 완전히 절제9후 그들의 후 각 전구를 개혁.
이 논문에서 우리 생활 tadpoles에 후 각 glomeruli의 이미징 행동 실험 연구 후 각 통로의 기능을 결합 하는 방법을 설명 합니다. 여기서 설명 하는 방법은 후 각 신경 transection10후 후 각 전구에 사 연결의 기능 회복을 공부 하 사용 되었다. Xenopus tadpoles에서 얻은 데이터는 척추 동물의 진화 후 각 처리 이므로 보존.
X. tropicalis 를 사용 하 여 설명 하는 방법 exemplified 하지만 그들은 X에서 쉽게 구현할 수 있습니다. laevis. 성인 X. laevis의 더 큰 크기에도 불구 하 고 두 종의 올챙이 단계 동안 현저 하 게 유사 하다. 주요 차이점은 게놈 수준에서 상주합니다. X. laevis allotetraploid 게놈 및 긴 생성 시간 (약 1 년)에 의해 주로 결정 가난한 유전자 추적성을 표시 합니다. 반대로, tropicalis 엑스는 더 짧은 생성 시간 (5-8 개월)와 2 중 게놈 유전자 수정 의무가. 대표적인 실험 동물 야생-타입 및 3 개의 다른 유전자 변형 라인에 대 한 설명 된다: Hb9:GFP (X. tropicalis), NBT:GFP (X. tropicalis) 및 tubb2:GFP (X. laevis).
현재 작업에 설명 된 방법론 Xenopus 필드에 유전 진행 함께 고려 되어야 한다. 단순 하 고 쉬운 구현 기술 제시의 그들이 이미 설명된 돌연변이11, CRISPR-Cas9 기술12에 의해 생성 된 Xenopus 라인 평가 하는 데 특히 유용 합니다. 우리는 또한 수술 Xenopus tadpoles에 액세스할 모든 실험실에서 구현할 수 있는 후 각 신경 transect를 사용을 설명 합니다. 연 접 칼슘 응답을 평가 하는 데 사용 하는 접근 하 고 후 각 기반 동작 임에도 불구 하 고 적절 한 비용에 사용할 수 있는 특정 장비를 요구. 방법론 연구 그룹에서 그들의 사용을 촉진 하는 간단한 형태로 제시 하 고 개선을 구현 하거나 다른 기술, 즉, 조직학 또는 유전 접근에 협회에 의해 더 복잡 한 분석의 기초를 설정할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 문서에 설명 합니다 생활에서 후 각 통로의 기능을 조사 하기 위해 유용한 기술 Xenopus tadpoles. 현재 프로토콜을 작동, 또는 Xenopus;에 접근이 그 실험실에 대 한 특히 유용 그러나, 그것은 또한 신경 재생 및 수리의 세포질과 분자 기초를 공부 하 고 그 연구에 대 한 흥미로운입니다. Xenopus 에서 얻은 결과 보존된 메커니즘을 식별 하기 위해 다른 척추 동물 모델에서 수집한 데이…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 엘 정부의 드 Economía y Competitividad (MINECO;에서 교부 금에 의해 지원 되었다 SAF2015-63568-R)에 의해는 유럽 지역 개발 기금 (ERDF), M. G. F. Fuortes 기념 친교, 스티븐 W. Kuffler 친교 기금로 라와 아서 Colwin 부여 여름 연구 친교 기금에서 경쟁력 있는 연구 수상에 의해 cofunded Fischbach 친교 및 해양 생물학 연구소는 국가 Xenopus 리소스 RRID:SCR_013731 (나무 구멍, MA)이이 작품의 일부 실시 했다의 위대한 세대 기금. 우리는 또한 검색 프로그램 감사 / Generalitat 드 Catalunya 제도적 지원에 대 한. 앨 러 배 마 세라 Húnter 연구원 이다입니다.
Materials
| Salts for aquariums (Instant Ocean Salt) | Tecniplast | XPSIO25R | |
| Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| Tweezers #5 (tip 0.025 x 0.005 mm) | World Precision Instruments | 501985 | |
| Vannas Scissors (tip 0.015 x 0.015) | World Precision Instruments | 501778 | |
| Whatman qualitative filter paper | Fisher Scientific | WH3030917 | |
| X. laevis tubb2-GFP | National Xenopus Resource (NXR), RRID:SCR_013731 | NXR_0.0035 | |
| X.tropicalis NBT-GFP | European Xenopus Resource Center (EXRC) RRID:SCR_007164 | ||
| CellTracker CM-DiI | ThermoFisher Scientific | C-7001 | |
| Calcium Green dextran, Potassium Salt, 10,000 MW, Anionic | ThermoFisher Scientific | C-3713 | |
| Borosilicate capillaries for microinjection | Sutter Instrument | B100-75-10 | O.D.=1.0 mm., I.D.=0.75 mm. |
| Puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| Microinjector | Parker Instruments | Picospritzer III | |
| Sylgard-184 | Sigma-Aldrich | 761028-5EA | |
| Microfil micropipettes | World Precision Instruments | MF28G-5 | |
| Upright microscope | Zeiss | AxioImager-A1 | |
| Master-8 stimulator | A.M.P.I. | ||
| CCD Camera | Hamamatsu | Image EM | |
| Solenoid valves | Warner Instruments | VC-6 Six Channel system | |
| Dow Corning High Vacuum Grease | VWR Scientific | 636082B | |
| Tubocurarine hydrochloride | Sigma-Aldrich | T2379 | |
| CCD Camera | Zeiss | MRC-5 Camera | Controlled by Zen software |
| camera lens | Thorlabs | MVL8ML3 | There are multiple possibilities that should be adapted to the camera model used |
| Epoxy resin | RS Components | ||
| Manifold | Warner Instruments | MP-6 perfusion manifold | |
| Micromanipulator for local delivery of solutions | Narishige | MN-153 | |
| Mini magnetic clamps | Warner Instruments | MAG-7, MAG-6 | |
| Polyethylene tubing | Warner Instruments | 64-0755 | O.D.=1.57 mm., I.D.=1.14 mm. |
References
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