Xenopus kurbağa yavrularını içinde vivo sinir sisteminin işlevi araştırmak için benzersiz bir platform sunuyoruz. Biz metodolojileri yaşayan koku bilgi işleme değerlendirmek için tarif Xenopus larva normal yetiştirme koşullarında veya yaralanma sonra.
Xenopus kurbağa yavrularını sinir sisteminin işlevi araştırmak için benzersiz bir platform sunuyoruz. Onlar çok sayıda görüntüleme yaklaşımlar, elektrofizyolojik teknikleri ve davranışsal deneyleri için erişilebilirlik gibi birden çok deneysel avantajlar sağlar. Xenopus iribaş koku alma sistemi normal gelişim sırasında kurulan veya yaralanma sonra reform sinapslarda işlevi araştırmak için özellikle uygundur. Burada, biz yaşayan koku bilgi işleme değerlendirmek için yöntemleri tarif Xenopus larvaları. Biz bir arada glomeruli koku güdümlü davranış deneyleri ile olfaktör ampul presynaptic kalsiyum tepkilerin içinde vivo ölçümlerin anahat. Yöntemleri Olfaktör sinirler sinaptik bağlantı hızına uyumlanma çalışmaya transeksiyon ile kombine edilebilir. Deneyler vahşi tipi ve genetiği değiştirilmiş hayvanlar GFP gazetecilere merkezi sinir sistemi hücrelerdeki ifade kullanarak sunulmaktadır. Uygulama için genetik olarak değiştirilmiş kurbağa yavrularını açıklanan yaklaşımların omurgalı davranışı tanımlayın moleküler üsleri çözülüyor için yararlı olabilir.
Xenopus kurbağa yavrularını sinir sisteminin normal işlevi eğitim için mükemmel bir hayvan model oluşturur. Şeffaflık, tam sıralı genom1,2ve cerrahi, elektrofizyolojik ve görüntüleme teknikleri erişilebilirlik nöronal işlevleri içinde vivo3 soruşturma izin Xenopus larva benzersiz özelliklerdir . Bazı hayvan bu modelin çok deneysel olasılık iribaş duyusal ve motor sistemleri4,5,6tarihinde gerçekleştirilen kapsamlı çalışmalar tarafından gösterilmiştir. Bilgi sinapslarda düzeyinde işlem birçok yönlerini incelemek için özellikle uygun bir nöronal devre Xenopus iribaş koku alma sistemi7‘ dir. İlk olarak, onun sinaptik bağlantı iyi tanımlanmış: koku reseptör nöronlar (ORNs) proje olfaktör ampul ve dendrites glomeruli koku eşleme içindeki mitral/tufted hücreleri ile sinaptik temas kurmak. İkinci olarak, onun ORNs sürekli neurogenesis koku yolları8işlevselliğini korumak için hayatı boyunca tarafından oluşturulur. Ve üçüncü olarak, Xenopus kurbağa yavrularını koku alma sistemi büyük bir rejeneratif yetenek gösterir çünkü tamamen onların olfaktör ampul ablasyon9‘ dan sonra reform yapabiliyor musunuz.
Bu yazıda, koku glomeruli yaşayan kurbağa yavrularını görüntüleme koku yolları işlevselliğini çalışmaya Davranışsal deney ile birleştirmek yaklaşımları açıklar. Burada ayrıntılı yöntemleri glomerular bağlantısı’nda olfaktör ampul fonksiyonel iyileşme Olfaktör sinir transeksiyon10‘ dan sonra eğitim için kullanılmıştır. Xenopus iribaşlar alınan verileri çoğu temsilcisi omurgalıların koku işleme evrimsel olduğu için korunmuş.
X. tropicalis kullanarak açıklanan yöntemleri örneği ama Xiçinde kolayca uygulanabilirdi. laevis. Yetişkin X. laevisdaha büyük boyutlarına rağmen her iki tür iribaş aşamaları sırasında oldukça benzer. Ana farklar genomik düzeyinde bulunur. X. laevis çoğunlukla onun allotetraploid genom ve uzun oluşturma süresi (yaklaşık 1 yıl) tarafından belirlenen zavallı genetik tractability görüntüler. Buna ek olarak, tropicalis X. daha kısa oluşturma süresi (5-8 ay) ve diploit genom nedeniyle genetik değişiklikler için mükellef. Temsilcisi deneyler vahşi-türü hayvanlar ve üç farklı transgenik satır için gösterilmiştir: Hb9:GFP (X. tropicalis), NBT:GFP (X. tropicalis) ve tubb2:GFP (X. laevis).
Geçerli çalışmalarında özetlenen metodolojileri Xenopus alanındaki genetik ilerledikçe birlikte düşünülmelidir. Sadelik ve sunulan teknikleri kolay uygulanması yapar onları zaten açıklanan mutantlar11, hem de CRISPR-Cas9 teknoloji12tarafından oluşturulan Xenopus satırları değerlendirmek için özellikle yararlı. Biz de Xenopus kurbağa yavrularını erişimi olan herhangi bir laboratuvar uygulanan Olfaktör sinirler transect için kullanılan bir cerrahi prosedür tanımlamak. Yaklaşımlar presynaptic kalsiyum yanıtları değerlendirmek için kullanılan ve koku güdümlü davranış gerektiren belirli donanımları, kullanılabilir olsa, ılımlı bir mal. Metodolojisi bunların kullanımı araştırma gruplarındaki tanıtmak için basit bir form içinde sunulan ve daha karmaşık deneyleri üsleri geliştirmeler uygulayarak ya da Derneğin diğer teknikleri, yani, histolojik veya genetik yaklaşımlar için ayarlayabilirsiniz.
Bu kağıt yaşayan koku yolları işlevselliğini araştırmak yararlı teknikler açıklanır Xenopus iribaşlar. Geçerli protokol işe veya Xenopuserişimi Bu laboratuarlar için yararlıdır; Ancak, bu da nöronal rejenerasyon ve onarım hücresel ve moleküler üsleri eğitim Bu araştırmacılar için ilginçtir. Xenopus elde edilen sonuçlar diğer omurgalı modellerinde korunmuş mekanizmaları tanımlamak için toplanan veriler ile kombine edilebilir. Açıklanan yöntemleri genetiği…
The authors have nothing to disclose.
Bu eser El “gayri resmi” de Economía y Competitividad (MINECO; dan gelen hibe tarafından desteklenmiştir SAF2015-63568-R) rekabetçi Araştırma Ödülleri M. G. F. Fuortes Memorial Bursu, Stephen W. Kuffler Burs Fonu, Laura ve Arthur Colwin donatılmış yaz araştırma bursu Fonu tarafından Avrupa Bölgesel Kalkınma Fonu (ERDF tarafından), cofunded , Fischbach Bursu ve büyük üretimi Fonu Deniz Biyoloji Laboratuvarı ve ulusal Xenopus kaynak nerede bu eser bir kısmını gerçekleştirilmiştir RRID:SCR_013731 (Woods Hole, MA). Eğer bir Program ayrıca teşekkür ederim / Generalitat de Catalunya kurumsal destek için. Al Serra Húnter biri.
Salts for aquariums (Instant Ocean Salt) | Tecniplast | XPSIO25R | |
Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) | Sigma-Aldrich | E10521 | |
Tweezers #5 (tip 0.025 x 0.005 mm) | World Precision Instruments | 501985 | |
Vannas Scissors (tip 0.015 x 0.015) | World Precision Instruments | 501778 | |
Whatman qualitative filter paper | Fisher Scientific | WH3030917 | |
X. laevis tubb2-GFP | National Xenopus Resource (NXR), RRID:SCR_013731 | NXR_0.0035 | |
X.tropicalis NBT-GFP | European Xenopus Resource Center (EXRC) RRID:SCR_007164 | ||
CellTracker CM-DiI | ThermoFisher Scientific | C-7001 | |
Calcium Green dextran, Potassium Salt, 10,000 MW, Anionic | ThermoFisher Scientific | C-3713 | |
Borosilicate capillaries for microinjection | Sutter Instrument | B100-75-10 | O.D.=1.0 mm., I.D.=0.75 mm. |
Puller | Sutter Instrument | P-97 | |
Microinjector | Parker Instruments | Picospritzer III | |
Sylgard-184 | Sigma-Aldrich | 761028-5EA | |
Microfil micropipettes | World Precision Instruments | MF28G-5 | |
Upright microscope | Zeiss | AxioImager-A1 | |
Master-8 stimulator | A.M.P.I. | ||
CCD Camera | Hamamatsu | Image EM | |
Solenoid valves | Warner Instruments | VC-6 Six Channel system | |
Dow Corning High Vacuum Grease | VWR Scientific | 636082B | |
Tubocurarine hydrochloride | Sigma-Aldrich | T2379 | |
CCD Camera | Zeiss | MRC-5 Camera | Controlled by Zen software |
camera lens | Thorlabs | MVL8ML3 | There are multiple possibilities that should be adapted to the camera model used |
Epoxy resin | RS Components | ||
Manifold | Warner Instruments | MP-6 perfusion manifold | |
Micromanipulator for local delivery of solutions | Narishige | MN-153 | |
Mini magnetic clamps | Warner Instruments | MAG-7, MAG-6 | |
Polyethylene tubing | Warner Instruments | 64-0755 | O.D.=1.57 mm., I.D.=1.14 mm. |