Funktionsauswertung olfaktorische Wege im Leben Xenopus Kaulquappen
Summary
Xenopus Kaulquappen bieten eine einzigartige Plattform, um die Funktion des Nervensystems in vivo zu untersuchen. Wir beschreiben Methoden zur Bewertung der Verarbeitung der Geruchsinformation im Wohnzimmer Xenopus Larven unter Normalbedingungen Aufzucht oder nach Verletzungen.
Abstract
Xenopus Kaulquappen bieten eine einzigartige Plattform, um die Funktion des Nervensystems zu untersuchen. Sie bieten mehrere experimentelle Vorteile, wie z. B. Zugriff auf zahlreiche bildgebende Ansätze, elektrophysiologische Techniken und Verhaltens-Assays. Das Xenopus Kaulquappe olfaktorische System eignet sich besonders gut zu untersuchen, die Funktion der Synapsen gegründet während der normalen Entwicklung oder nach einer Verletzung reformiert. Hier beschreiben wir Methoden zur Bewertung der Verarbeitung der Geruchsinformation im Wohnzimmer Xenopus Larven. Wir skizzieren eine Kombination aus in-vivo Messungen der präsynaptischen Kalzium Antworten in Glomeruli den Riechkolben mit olfaktorischen geführte Verhalten Assays. Methoden können mit der Durchtrennung der Geruchsnerven, studieren die Neuverkabelung der synaptischen Konnektivität kombiniert werden. Experimente werden vorgestellt mit Wildtyp und gentechnisch veränderte Tiere mit dem Ausdruck GFP-Reporter in den Zellen des zentralen Nervensystems. Anwendung der Ansätze beschrieben, gentechnisch veränderten Kaulquappen ist nützlich für die Entschlüsselung der molekularen Grundlagen, die vertebrate Verhalten definieren.
Introduction
Xenopus Kaulquappen bilden ein ausgezeichnetes Tiermodell um die normale Funktion des Nervensystems zu studieren. Transparenz, ein vollständig sequenzierte Genom1,2und Zugänglichkeit zu chirurgischen, elektrophysiologische und bildgebende Techniken sind einzigartige Eigenschaften des Xenopus -Larven, die es ermöglichen, Untersuchung neuronale Funktionen in-vivo3 . Einige der mehrere experimentelle Möglichkeiten dieses Tiermodell werden durch gründliche Studien am Kaulquappe sensorischen und motorischen Systeme4,5,6dargestellt. Eine besonders gut geeignet neuronale Schaltung, viele Aspekte der Informationsverarbeitung auf der Ebene der Synapsen ist Xenopus Kaulquappe olfaktorischen System7. Erstens die synaptische Konnektivität ist klar definiert: olfaktorische Rezeptor Neuronen (ORNs) Projekt auf den Riechkolben und synaptischen Kontakte mit Dendriten Mitral-/getuftet Zellen innerhalb von Glomeruli Geruch Karten zu generieren. Zweitens entstehen seine ORNs kontinuierlich durch Neurogenese während des gesamten Lebens die Funktionalität von olfaktorische Bahnen8zu erhalten. Und drittens, weil des olfaktorischen Systems eine große regenerative Fähigkeit zeigt, Xenopus Kaulquappen können ihre Riechkolben ganz nach Ablation9zu reformieren.
In diesem Artikel beschreiben wir Ansätze, die Darstellung der olfaktorischen Glomeruli in lebenden Kaulquappen mit Verhaltensexperimente, die Funktionalität der olfaktorische Bahnen zu studieren. Die hier beschriebenen Methoden wurden verwendet, um die funktionelle Wiederherstellung der glomerulären Konnektivität in den Riechkolben nach Riechnerv Durchtrennung10zu studieren. In Xenopus Kaulquappen gewonnenen Daten sind Vertreter der Wirbeltiere, da olfaktorische Verarbeitung evolutionär ist konserviert.
Die beschriebenen Methoden sind beispielhaft dargestellt, mit X. tropicalis , aber sie können leicht in Xumgesetzt werden. Laevis. Trotz der größeren Größe des Erwachsenen laevissind beide Arten in Kaulquappe Phasen bemerkenswert ähnlich. Die Hauptunterschiede liegen auf Genomebene. Laevis zeigt schlechte genetische Lenkbarkeit, vor allem durch seine Allotetraploid Genom und lange Generationszeit (ca. 1 Jahr) bestimmt. X. Tropicalis ist dagegen besser geeignet, um genetische Veränderungen aufgrund der kürzeren Generationszeit (5 – 8 Monate) und diploiden Genom. Die repräsentative Experimente sind für Wildtyp Tiere und drei verschiedenen transgenen Linien dargestellt: Hb9:GFP (X. tropicalis), NBT:GFP (X. tropicalis) und Tubb2:GFP (laevis).
Die in die aktuelle Arbeit beschriebenen Methoden sollte neben der genetischen fortschreitet im Feld Xenopus betrachtet werden. Die Einfachheit und die einfache Umsetzung der vorgestellten Techniken macht sie besonders nützlich für die Bewertung der bereits beschriebenen Mutanten11sowie Xenopus Linien von CRISPR-Cas9 Technologie12generiert. Wir beschreiben auch einen chirurgischen Eingriff zur Geruchsnerven Transekt, die in jedem Labor Zugang zu Xenopus Kaulquappen umgesetzt werden können. Die Ansätze für die Bewertung der präsynaptischen Kalzium Antworten verwendet und olfaktorischen geführte Verhalten erfordern spezielle Ausrüstung, wenn auch auf einem moderaten Kosten zur Verfügung. Methoden sind in einer einfachen Form zur Förderung ihrer Verwendung in Forschungsgruppen vorgestellt und konnte die Grundlagen von komplexeren Assays festgelegt, durch die Implementierung von Verbesserungen oder durch den Verein zu anderen Techniken, d.h., histologische oder genetische Ansätze.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Papier beschreibt Techniken, die sinnvoll, die Funktionalität der olfaktorische Wege im Leben zu untersuchen sind Xenopus Kaulquappen. Das aktuelle Protokoll eignet sich besonders für die Laboratorien, die funktionieren, oder haben Zugang zu Xenopus; Allerdings ist es auch interessant für jene Forscher studieren die zellulären und molekularen Grundlagen der neuronale Regeneration und Reparatur. Ergebnisse im Xenopus kombinierbar mit Daten aus anderen vertebrate Modelle, konservierte …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse aus El Ministerio de Economía y Competitividad (MINECO; SAF2015-63568-R) mitfinanziert von European Regional Development Fonds (EFRE), durch wettbewerbsfähige Forschungspreise aus der M. G. F. Fuortes Memorial Fellowship, Stephen W. Kuffler Stipendium Fonds, Laura und Arthur Colwin ausgestattet Sommer Research Fellowship Fund , das Fischbach Fellowship und der große Generation Fund der Marine Biological Laboratory und der nationalen Xenopus Ressource RRID:SCR_013731 (Woods Hole, Massachusetts) wo ein Teil dieser Arbeit wurde durchgeführt. Wir danken auch CERCA Programm / Generalitat de Catalunya für institutionelle Unterstützung. A.L. ist Serra Húnter Fellow.
Materials
| Salts for aquariums (Instant Ocean Salt) | Tecniplast | XPSIO25R | |
| Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| Tweezers #5 (tip 0.025 x 0.005 mm) | World Precision Instruments | 501985 | |
| Vannas Scissors (tip 0.015 x 0.015) | World Precision Instruments | 501778 | |
| Whatman qualitative filter paper | Fisher Scientific | WH3030917 | |
| X. laevis tubb2-GFP | National Xenopus Resource (NXR), RRID:SCR_013731 | NXR_0.0035 | |
| X.tropicalis NBT-GFP | European Xenopus Resource Center (EXRC) RRID:SCR_007164 | ||
| CellTracker CM-DiI | ThermoFisher Scientific | C-7001 | |
| Calcium Green dextran, Potassium Salt, 10,000 MW, Anionic | ThermoFisher Scientific | C-3713 | |
| Borosilicate capillaries for microinjection | Sutter Instrument | B100-75-10 | O.D.=1.0 mm., I.D.=0.75 mm. |
| Puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| Microinjector | Parker Instruments | Picospritzer III | |
| Sylgard-184 | Sigma-Aldrich | 761028-5EA | |
| Microfil micropipettes | World Precision Instruments | MF28G-5 | |
| Upright microscope | Zeiss | AxioImager-A1 | |
| Master-8 stimulator | A.M.P.I. | ||
| CCD Camera | Hamamatsu | Image EM | |
| Solenoid valves | Warner Instruments | VC-6 Six Channel system | |
| Dow Corning High Vacuum Grease | VWR Scientific | 636082B | |
| Tubocurarine hydrochloride | Sigma-Aldrich | T2379 | |
| CCD Camera | Zeiss | MRC-5 Camera | Controlled by Zen software |
| camera lens | Thorlabs | MVL8ML3 | There are multiple possibilities that should be adapted to the camera model used |
| Epoxy resin | RS Components | ||
| Manifold | Warner Instruments | MP-6 perfusion manifold | |
| Micromanipulator for local delivery of solutions | Narishige | MN-153 | |
| Mini magnetic clamps | Warner Instruments | MAG-7, MAG-6 | |
| Polyethylene tubing | Warner Instruments | 64-0755 | O.D.=1.57 mm., I.D.=1.14 mm. |
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