Hochdurchsatz-Identifizierung des Gens regulatorischen Sequenzen mit Next-Generation Sequenzierung der kreisförmigen Chromosom Konformation erfassen (4C-Seq)
Summary
Die Kennung der physikalischen Wechselwirkungen zwischen Genen und regulatorische Elemente ist anspruchsvoll aber erfassen Bezahlungsmethode Chromosom Konformation erleichtert worden. Diese Modifikation des 4C-Seq-Protokolls mildert PCR Bias durch Minimierung der Überverstärkung PCR-Vorlagen und maximiert die Mappability von Lesevorgängen durch den Einbau eines Zusatz Restriktionsenzym verdauen Schritt.
Abstract
Die Identifizierung regulatorischer Elemente für ein bestimmtes Zielgen stellt eine große technische Herausforderung aufgrund der Variabilität in der Positionierung und Wirkung Größen regulatorischer Elemente zu einem Zielgen. Mit bioinformatischen Vorhersage der Existenz und Funktion des proximalen epigenetische Veränderungen verbunden mit aktivierten Genexpression mit konservierten Transkription Faktor Bindungsstellen sind einige Fortschritte erzielt worden. Chromatin Konformation erfassen Studien revolutionierten unsere Fähigkeit, körperliche Chromatin Kontakte zwischen Sequenzen und sogar innerhalb eines gesamten Genoms zu entdecken. Kreisförmige Chromatin Konformation Erfassung gepaart mit Next Generation Sequencing (4C-FF), insbesondere soll alle möglichen physischen Chromatin Interaktionen für eine bestimmte Sequenz von Interesse (Aussichtspunkt), entdecken wie ein Zielgen oder eine behördliche Enhancer. Aktuelle 4C-Seq-Strategien direkt Sequenz von innerhalb der Sicht aber erfordern zahlreiche und vielfältige Sichtweisen gleichzeitig sequenziert werden, um die technischen Herausforderungen der Uniform zu vermeiden mit Plattformen der nächsten Generation Sequenzierung base aufrufen (Imaging). Dieses Volumen von Experimente möglicherweise nicht praktisch für viele Labors. Hier berichten wir über einen modifizierten Ansatz des 4C-Seq-Protokolls, das beinhaltet eine zusätzliche Restriktionsenzym verdauen und qPCR-basierte Verstärkung Schritte, mit denen eine größere Aufnahme des vielfältigen Abfolge lautet erleichtern und verringern das Potenzial für PCR-bias, beziehungsweise. Unsere modifizierte 4C Methode ist geeignet, um die standard molekularbiologischen Labor zur Beurteilung von Chromatin Architektur.
Introduction
Die Identifizierung regulatorischer Elemente für die Genexpression wurde durch die Enzyklopädie von DNA-Elemente (ENCODE) Projekt erleichtert, die funktionelle Aktivität für 80 % des menschlichen Genoms1,2umfassend kommentiert. Die Identifizierung der Standorte für in Vivo Transkription Faktor Bindung, DNaseI Überempfindlichkeit und epigenetischen Histon und DNA-Methylierungänderungen in einzelnen Zelltypen ebnete den Weg für die Funktionsanalysen des Kandidaten regulatorischen Elemente für Ziel-gen-Expression. Bewaffnet mit diesen Erkenntnissen, stehen wir vor der Herausforderung, zur Bestimmung der funktionellen Interkonnektivität zwischen regulatorische Elemente und Gene. Speziell, was die Beziehung zwischen einem bestimmten Zielgen und seine Enhancer(s) ist? Die Chromatin Konformation Capture (3C)-Methode-Adressen direkt diese Frage durch identifizierende körperliche und wahrscheinlich funktional, Interaktionen zwischen einer Region of Interest und Kandidat Interaktion Sequenzen durch aufgezeichneten Ereignisse in festen Chromatin3 . Da unser Verständnis von Chromatin Interaktionen zugenommen hat, ist es jedoch klar, dass die Untersuchung der vorausgewählten Kandidaten Loci nicht ausreicht, um ein vollständiges Verständnis der Gen-Enhancer Interaktionen zur Verfügung zu stellen. Zum Beispiel ENCODE Hochdurchsatz-chromosomalen Konformation Capture-Kopie (5C)-Methode verwendet, um einen kleinen Teil des menschlichen Genoms (1 %, pilot set 44 Loci) untersuchen und komplexe Vernetzung der Loci berichtet. Gene und Geschmacksverstärker mit identifizierten Interaktionen durchschnittlich 2 – 4 verschiedenen Interaktionspartnern, von die viele Hunderte von Kilobases entfernt in linearen Raum4waren. Darüber hinaus Li Et Al. Chromatin-Interaktions-Analyse durch Paired-End Tag Sequenzierung (ChIA-PET) zur Vollständiggenom Promotor Interaktionen zu analysieren und festgestellt, dass 65 % der RNA-Polymerase II Bindungsstellen an Chromatin Interaktionen beteiligt waren. Einige dieser Interaktionen führte zu großen, Multi-gen komplexe umfasst hunderte von Kilobases der genomischen Distanz und mit durchschnittlich 8-9 Gene jeweils5. Zusammen, unterstreichen diese Ergebnisse die Notwendigkeit für unvoreingenommene Vollständiggenom Methoden zur Abfrage von Chromatin Interaktionen. Einige dieser Methoden sind im Schmitt Et al.überprüft. 6.
Neuere Methoden zur Chromatin Konformation erfassen Studien gepaart mit Next-Generation Sequenzierung (Hi-C und 4C-Seq) ermöglichen die Entdeckung des unbekannten Sequenzen, die Interaktion mit einer Region von Interesse6. Kreisförmigen Chromosom Konformation Aufnahme mit Next Generation Sequencing (4C-Seq) wurde speziell für Loci, die Interaktion mit einer Abfolge von Interesse an eine unvoreingenommene Weise7 durch Sequenzierung von DNA aus aufgenommenen Chromatin proximal zu identifizieren die Region des Interesses im 3D-Raum. Kurz gesagt, ist Chromatin befestigt bewahren seine native Protein-DNA-Wechselwirkungen, mit einem Restriktionsenzym gespalten und anschließend ligiert verdünnte Bedingungen biologisch relevante “Verwicklungen” interagierenden Loci (Abbildung 1) zu erfassen. Die Querverbindungen sind umgekehrt, um das Protein, wodurch die DNA für zusätzliche Spaltung mit einem zweiten Restriktionsenzym entfernt. Eine endgültige Verbindung erzeugt kleinere Kreise der interagierenden Loci. Primer an die Reihenfolge des Interesses werden dann verwendet, um eine verstärkte Bibliothek von unbekannten Sequenzen aus circularized Fragmente, gefolgt von nachgelagerte Sequenzierung der nächsten Generation zu generieren.
Das Protokoll hier vorgestellten, dessen Schwerpunkt Probenvorbereitung macht zwei wichtige Änderungen an bestehenden 4C-Seq Methoden8,9,10,11,12. Zunächst wird eine qPCR basierende Methode um empirisch zu bestimmen, die optimale Anzahl der Verstärkung Zyklen für 4C-Seq Bibliothek Vorbereitungsschritte und mindert somit das Potenzial für PCR-Bias aus Überverstärkung Bibliotheken. Zweitens wird einen zusätzliche Einschränkung Digest Schritt in dem Bemühen um die Einheitlichkeit der bekannten “Köder” Sequenzen zu reduzieren, die behindert genaue Basis-Aufruf durch das Instrument der Sequenzierung und somit maximiert die einzigartigen, informative Reihenfolge bei jedem Lesevorgang. Andere Protokolle umgehen dieses Problem durch die Bündelung von vielen (12-15)8 4 C-Seq Bibliotheken mit verschiedenen Köder Sequenzen bzw. Restriktionsschnittstellen, ein Volumen von Experimente, die von anderen Labors nicht erreicht werden kann. Die hier vorgestellten Änderungen erlauben eine kleine Anzahl von Experimenten, Proben, und/oder repliziert werden indiziert und gebündelt in einer einzigen Spur.
Protocol
Representative Results
Discussion
4C Ergebnisse haben das Potenzial, Chromatin-Interaktionen, die bisher unbekannte regulatorischen Elemente identifizieren können und/oder Zielgene, die wichtig sind in einem bestimmten biologischen Kontext24,25,26zu offenbaren. Technische Hürden schränken jedoch die Daten aus diesen Experimenten. PCR-Bias aus Überverstärkung Vorlage in 4 C Protokolle ist wahrscheinlich. Dieses Protokoll behebt dieses Problem durch die Verwe…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch NIAMS (R01AR065523) unterstützt.
Materials
| HindIII | NEB | R0104S | |
| CviQI | NEB | R0639S | |
| DNA oligonucleotide primers | IDT | To be designed by the reader | |
| 50 mL conical centrifuge tubes | Fisher Scientific | 06-443-19 | |
| 1.7 mL microcentrifuge tubes | MidSci | AVSS1700 | |
| Phosphate buffered saline | Thermo Fisher | 14190-136 | |
| Formaldehyde, methanol free | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Nutator | VWR | 15172-203 | |
| Glycine | JT Baker | 4059-00 | |
| Benchtop centrifuge | |||
| Refrigerated microcentrifuge | |||
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | ED2SS | |
| 20% SDS solution | Sigma-Aldrich | 05030 | |
| Trypan Blue | Thermo Fisher | 15250061 | |
| Glass slides | Fisher Scientific | 12-550-143 | |
| Cover slips | VWR | 16004-094 | |
| Light microscope | |||
| Triton X-100 | Alfa Aesar | A16046 | |
| Shaking heat block | |||
| 2M Tris-HCl | Quality Biological | 351-048-101 | |
| Proteinase K | NEB | P8107S | |
| Phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1) | Sigma-Aldrich | P2069 | |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | M5661 | |
| 20 mg/mL glycogen | Thermo Fisher | R0561 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | 04-355-223 | |
| Nuclease-free water | Fisher Scientific | MT-46-000-CM | |
| qPCR cycler | Thermo Fisher | 4453536 | |
| qPCR plates | Thermo Fisher | 4309849 | |
| Thermocycler | Thermo Fisher | 4375786 | |
| PCR strip tubes | MidSci | AVSST-FL | |
| 1M Magnesium chloride | Quality Biological | 351-033-721 | |
| Dithiothreotol | Sigma-Aldrich | 43815 | |
| Adenosine triphosphate | Sigma-Aldrich | A2383 | |
| T4 DNA Ligase | NEB | M0202S | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A6013 | |
| RNase A | Thermo Fisher | EN0531 | |
| Qiaquick PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
| MinElute PCR Purification kit | Qiagen | 28004 | |
| Spectrophotometer | |||
| Expand Long Template PCR System | Sigma-Aldrich | 11681834001 | |
| dNTP mix | Thermo Fisher | R0191 | |
| SYBR Green I | Sigma-Aldrich | S9430 | |
| ROX | BioRad | 172-5858 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| End-It DNA End-Repair Kit | Lucigen | ER0720 | |
| LigaFast Rapid DNA Ligation System | Promega | M8221 | |
| SYBR Safe | Thermo Fisher | S33102 | |
| Taq Polymerase | NEB | M0267S | |
| UltraSieve Agarose | IBI Scientific | IB70054 | |
| Qiaquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 |
References
- Dunham, I., et al. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
- Hoffman, M. M., et al. Integrative annotation of chromatin elements from ENCODE data. Nucleic Acids Research. 41 (2), 827-841 (2013).
- Dekker, J., Rippe, K., Dekker, M., Kleckner, N. Capturing Chromosome Conformation. Science. 295 (5558), 1306-1311 (2002).
- Sanyal, A., Lajoie, B. R., Jain, G., Dekker, J. The long-range interaction landscape of gene promoters. Nature. 489 (7414), 109-113 (2012).
- Li, G., et al. Extensive promoter-centered chromatin interactions provide a topological basis for transcription regulation. Cell. 148 (1-2), 84-98 (2012).
- Schmitt, A. D., Hu, M., Ren, B. Genome-wide mapping and analysis of chromosome architecture. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (12), 743-755 (2016).
- Zhao, Z., et al. Circular chromosome conformation capture (4C) uncovers extensive networks of epigenetically regulated intra- and interchromosomal interactions. Nature genetics. 38 (11), 1341-1347 (2006).
- Splinter, E., de Wit, E., van de Werken, H. J. G., Klous, P., de Laat, W. Determining long-range chromatin interactions for selected genomic sites using 4C-seq technology: From fixation to computation. Methods. 58 (3), 221-230 (2012).
- Van De Werken, H. J. G., et al. 4C technology: Protocols and data analysis. Methods in Enzymology. 513, (2012).
- Brouwer, R. W. W., van den Hout, M. C. G. N., van IJcken, W. F. J., Soler, E., Stadhouders, R. Unbiased Interrogation of 3D Genome Topology Using Chromosome Conformation Capture Coupled to High-Throughput Sequencing (4C-Seq). Eukaryotic Transcriptional and Post-Transcriptional Gene Expression Regulation. , 199-220 (2017).
- Matelot, M., Noordermeer, D. Determination of High-Resolution 3D Chromatin Organization Using Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq). Polycomb Group Proteins: Methods and Protocols. , 223-241 (2016).
- Gheldof, N., Leleu, M., Noordermeer, D., Rougemont, J., Reymond, A. Detecting Long-Range Chromatin Interactions Using the Chromosome Conformation Capture Sequencing (4C-seq) Method. Gene Regulatory Networks: Methods and Protocols. , 211-225 (2012).
- Göndör, A., Rougier, C., Ohlsson, R. High-resolution circular chromosome conformation capture assay. Nature. 3 (2), 303-313 (2008).
- Hagège, H., et al. Quantitative analysis of chromosome conformation capture assays (3C-qPCR). Nature. 2 (7), 1722-1733 (2007).
- Anand, R. D., Sertil, O., Lowry, C. V. Restriction digestion monitors facilitate plasmid construction and PCR cloning. BioTechniques. 36 (6), 982-985 (2004).
- Afgan, E., et al. The Galaxy platform for accessible, reproducible and collaborative biomedical analyses: 2016 update. Nucleic acids research. 44 (W1), W3-W10 (2016).
- Li, H., Durbin, R. Fast and accurate long-read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics. 26 (5), 589-595 (2010).
- Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
- Walter, C., Schuetzmann, D., Rosenbauer, F., Dugas, M. Basic4Cseq: An R/Bioconductor package for analyzing 4C-seq data. Bioinformatics. 30 (22), 3268-3269 (2014).
- Raviram, R., et al. 4C-ker: A Method to Reproducibly Identify Genome-Wide Interactions Captured by 4C-Seq Experiments. PLoS Computational Biology. 12 (3), (2016).
- Klein, F. A., Pakozdi, T., Anders, S., Ghavi-helm, Y., Furlong, E. E. M., Huber, W. FourCSeq: analysis of 4C sequencing data. Bioinformatics. 31 (19), 3085-3091 (2015).
- Williams, R. L., et al. fourSig a method for determining chromosomal interactions in 4C-Seq data. Nucleic Acids Research. 42 (8), (2014).
- McLean, C. Y., et al. GREAT improves functional interpretation of cis-regulatory regions. Nature Biotechnology. 28 (5), 495-501 (2010).
- Stolzenburg, L. R., et al. Regulatory dynamics of 11p13 suggest a role for EHF in modifying CF lung disease severity. Nucleic Acids Research. 45 (15), 8773-8784 (2017).
- Meddens, C. A., et al. Systematic analysis of chromatin interactions at disease associated loci links novel candidate genes to inflammatory bowel disease. Genome Biology. 17 (1), 1-15 (2016).
- Yeung, J., et al. Transcription factor activity rhythms and tissue-specific chromatin interactions explain circadian gene expression across organs. Genome research. , 207787 (2017).
