Identificação do elevado-throughput de sequências de genes regulatórios utilizando a próxima geração sequenciamento de conformação Circular cromossoma capturar (4C-seq)
Summary
A identificação das interações físicas entre genes e dos elementos reguladores é um desafio, mas tem sido facilitada pelos métodos de captura de conformação de cromossomo. Esta modificação no protocolo de 4C-seq atenua o viés PCR, minimizando a amplificação excessiva de modelos PCR e maximiza o mappability de leituras, incorporando um passo de digerir adição da enzima de restrição.
Abstract
A identificação dos elementos reguladores para um gene determinado alvo constitui um desafio técnico significativo devido à variabilidade nos tamanhos de posicionamento e efeito de elementos reguladores de um gene alvo. Alguns progressos com a previsão de bioinformatic da existência e função de proximais modificações epigenéticas associadas com a expressão de gene ativado usando locais de ligação do fator de transcrição conservada. Estudos de captura de conformação da cromatina tem revolucionado nossa habilidade para descobrir contatos físicos cromatina entre sequências e mesmo dentro de um genoma inteiro. Captura de conformação de cromatina circular juntamente com a próxima geração sequenciamento (4C-seq), em particular, é projetada para descobrir todas as possíveis interações físicas da cromatina para uma determinada sequência de interesse (ponto de vista), como um gene alvo ou uma regulamentação atrapalha… Estratégias atuais de 4C-seq diretamente sequência de dentro do ponto de vista, mas exigem numerosos e diversos pontos de vista a ser sequenciado simultaneamente para evitar os desafios técnicos de uniforme base chamando (imagem) com plataformas de sequenciamento de próxima geração. Este volume de experiências pode não ser prático para muitos laboratórios. Aqui, nós relatamos uma abordagem modificada do protocolo 4C-seq que incorpora tanto um digest de enzima de restrição adicional e etapas de amplificação qPCR-baseado que são projetadas para facilitar uma maior captura de sequência diversas leituras e mitigar o potencial para Viés de PCR, respectivamente. Nosso método de 4C modificado é passível de laboratório padrão de biologia molecular para avaliar a arquitetura da cromatina.
Introduction
A identificação dos elementos reguladores para a expressão de gene tem sido facilitada pelo projeto livre de elementos de DNA (ENCODE) que exaustivamente anotada atividade funcional para 80% do genoma humano1,2. A identificação dos locais para na vivo vinculação de fator de transcrição, DNaseI hipersensibilidade e epigenética histona e modificações de metilação do DNA em tipos de células individuais pavimentou o caminho para a análise funcional do candidato regulamentar elementos para a expressão do gene alvo. Armado com estas conclusões, nos deparamos com o desafio de determinar a interconectividade funcional entre genes e dos elementos reguladores. Especificamente, qual é a relação entre um gene alvo determinado e sua enhancer(s)? O método de captura (3c) conformação da cromatina aborda directamente esta questão por interações funcionais, físicas e prováveis identificação entre uma região de interesse e candidato interagindo sequências por meio de eventos capturados na cromatina fixo3 . Como nossa compreensão das interações de cromatina aumentou, no entanto, é evidente que a investigação dos loci candidatos pré-selecionados é insuficiente para fornecer uma compreensão completa das interações gene-realçador. Por exemplo, ENCODE utilizado o método de cópia carbono (5C) de captura de conformação cromossômica de alto rendimento para examinar uma pequena porção do genoma humano (1%, piloto conjunto dos 44 loci) e relatado complexa interconectividade dos loci. Genes e realçadores com interações identificadas em média diferentes parceiros de interação 2 – 4, muitas das quais foram centenas de kilobases afastado no espaço linear4. Além disso, Li et al. usado análise de interação cromatina pela cobertura-final Tag sequenciamento (ChIA-PET) para analisar interações promotor do inteiro-genoma e encontrado que 65% dos sítios de ligação II RNA polimerase estiveram envolvidos em interações de cromatina. Algumas dessas interações resultaram em grandes, genes multi complexos, abrangendo centenas de kilobases de distância genômica e que contém, em média, 8-9 genes cada5. Juntos, esses achados destacam a necessidade de imparcial do inteiro-genoma métodos para interrogar interações de cromatina. Alguns desses métodos são revistos em Schmitt et al. 6.
Métodos mais recentes para estudos de captura de conformação da cromatina juntamente com geração de sequenciamento (Hi-C e 4C-seq) habilitar a descoberta do desconhecido sequências interagindo com uma região de interesse6. Especificamente, a captura de conformação circular cromossoma com sequenciamento de nova geração (4C-seq) foi desenvolvida para identificar loci interagindo com uma sequência de interesse em uma forma imparcial7 por sequenciamento de DNA de cromatina capturada proximal para o região de interesse no espaço 3D. Brevemente, a cromatina é fixo para preservar suas interações da proteína-DNA nativo, clivado com uma enzima de restrição e posteriormente ligados em condições diluir para capturar biologicamente relevantes “emaranhados” dos loci interagindo (Figura 1). As ligações cruzadas são revertidas para remover a proteína, deixando assim o DNA disponível para a segmentação adicional com uma segunda enzima de restrição. Uma ligadura final gera círculos menores dos loci interagindo. Primers para a sequência de interesse são usados para gerar uma biblioteca amplificada de sequências desconhecidas dos fragmentos circularizou, seguidos de sequenciação de geração próxima a jusante.
O protocolo apresentado aqui, que se concentra na preparação da amostra, faz duas alterações principais existentes 4C-seq métodos8,9,10,11,12. Primeiro, ele usa um método baseado em qPCR para determinar empiricamente o número ideal de amplificação ciclos para as etapas de preparação de biblioteca 4C-seq e assim reduz o potencial para viés PCR decorrentes de excesso de amplificação de bibliotecas. Em segundo lugar, ele usa um restrição adicional digerir passo em um esforço para reduzir a uniformidade das sequências conhecidas de “isca” que impede a exata base-chamada pelo instrumento sequenciamento e, daí, maximiza a sequência original, informativa em cada leitura. Outros protocolos de contornar este problema por pool de muitas bibliotecas de 4C-seq8 (12-15) com isca diferentes sequências e/ou locais de limitação, um volume de experiências que pode não ser alcançável por outros laboratórios. As modificações apresentadas aqui permitem que um pequeno número de experimentos, amostras e/ou Replica para ser indexado e agrupados em uma única faixa.
Protocol
Representative Results
Discussion
4C resultados têm o potencial para revelar interações de cromatina que podem identificar elementos normativos anteriormente desconhecidos e/ou genes-alvo que são importantes em um contexto específico biológico24,25,26. No entanto, barreiras técnicas podem limitar os dados obtidos a partir dessas experiências. Viés PCR decorrentes de amplificação excessiva do modelo em protocolos 4C é provável. Este protocolo aborda …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pela NIAMS (R01AR065523).
Materials
| HindIII | NEB | R0104S | |
| CviQI | NEB | R0639S | |
| DNA oligonucleotide primers | IDT | To be designed by the reader | |
| 50 mL conical centrifuge tubes | Fisher Scientific | 06-443-19 | |
| 1.7 mL microcentrifuge tubes | MidSci | AVSS1700 | |
| Phosphate buffered saline | Thermo Fisher | 14190-136 | |
| Formaldehyde, methanol free | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Nutator | VWR | 15172-203 | |
| Glycine | JT Baker | 4059-00 | |
| Benchtop centrifuge | |||
| Refrigerated microcentrifuge | |||
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | ED2SS | |
| 20% SDS solution | Sigma-Aldrich | 05030 | |
| Trypan Blue | Thermo Fisher | 15250061 | |
| Glass slides | Fisher Scientific | 12-550-143 | |
| Cover slips | VWR | 16004-094 | |
| Light microscope | |||
| Triton X-100 | Alfa Aesar | A16046 | |
| Shaking heat block | |||
| 2M Tris-HCl | Quality Biological | 351-048-101 | |
| Proteinase K | NEB | P8107S | |
| Phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1) | Sigma-Aldrich | P2069 | |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | M5661 | |
| 20 mg/mL glycogen | Thermo Fisher | R0561 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | 04-355-223 | |
| Nuclease-free water | Fisher Scientific | MT-46-000-CM | |
| qPCR cycler | Thermo Fisher | 4453536 | |
| qPCR plates | Thermo Fisher | 4309849 | |
| Thermocycler | Thermo Fisher | 4375786 | |
| PCR strip tubes | MidSci | AVSST-FL | |
| 1M Magnesium chloride | Quality Biological | 351-033-721 | |
| Dithiothreotol | Sigma-Aldrich | 43815 | |
| Adenosine triphosphate | Sigma-Aldrich | A2383 | |
| T4 DNA Ligase | NEB | M0202S | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A6013 | |
| RNase A | Thermo Fisher | EN0531 | |
| Qiaquick PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
| MinElute PCR Purification kit | Qiagen | 28004 | |
| Spectrophotometer | |||
| Expand Long Template PCR System | Sigma-Aldrich | 11681834001 | |
| dNTP mix | Thermo Fisher | R0191 | |
| SYBR Green I | Sigma-Aldrich | S9430 | |
| ROX | BioRad | 172-5858 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| End-It DNA End-Repair Kit | Lucigen | ER0720 | |
| LigaFast Rapid DNA Ligation System | Promega | M8221 | |
| SYBR Safe | Thermo Fisher | S33102 | |
| Taq Polymerase | NEB | M0267S | |
| UltraSieve Agarose | IBI Scientific | IB70054 | |
| Qiaquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 |
References
- Dunham, I., et al. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
- Hoffman, M. M., et al. Integrative annotation of chromatin elements from ENCODE data. Nucleic Acids Research. 41 (2), 827-841 (2013).
- Dekker, J., Rippe, K., Dekker, M., Kleckner, N. Capturing Chromosome Conformation. Science. 295 (5558), 1306-1311 (2002).
- Sanyal, A., Lajoie, B. R., Jain, G., Dekker, J. The long-range interaction landscape of gene promoters. Nature. 489 (7414), 109-113 (2012).
- Li, G., et al. Extensive promoter-centered chromatin interactions provide a topological basis for transcription regulation. Cell. 148 (1-2), 84-98 (2012).
- Schmitt, A. D., Hu, M., Ren, B. Genome-wide mapping and analysis of chromosome architecture. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (12), 743-755 (2016).
- Zhao, Z., et al. Circular chromosome conformation capture (4C) uncovers extensive networks of epigenetically regulated intra- and interchromosomal interactions. Nature genetics. 38 (11), 1341-1347 (2006).
- Splinter, E., de Wit, E., van de Werken, H. J. G., Klous, P., de Laat, W. Determining long-range chromatin interactions for selected genomic sites using 4C-seq technology: From fixation to computation. Methods. 58 (3), 221-230 (2012).
- Van De Werken, H. J. G., et al. 4C technology: Protocols and data analysis. Methods in Enzymology. 513, (2012).
- Brouwer, R. W. W., van den Hout, M. C. G. N., van IJcken, W. F. J., Soler, E., Stadhouders, R. Unbiased Interrogation of 3D Genome Topology Using Chromosome Conformation Capture Coupled to High-Throughput Sequencing (4C-Seq). Eukaryotic Transcriptional and Post-Transcriptional Gene Expression Regulation. , 199-220 (2017).
- Matelot, M., Noordermeer, D. Determination of High-Resolution 3D Chromatin Organization Using Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq). Polycomb Group Proteins: Methods and Protocols. , 223-241 (2016).
- Gheldof, N., Leleu, M., Noordermeer, D., Rougemont, J., Reymond, A. Detecting Long-Range Chromatin Interactions Using the Chromosome Conformation Capture Sequencing (4C-seq) Method. Gene Regulatory Networks: Methods and Protocols. , 211-225 (2012).
- Göndör, A., Rougier, C., Ohlsson, R. High-resolution circular chromosome conformation capture assay. Nature. 3 (2), 303-313 (2008).
- Hagège, H., et al. Quantitative analysis of chromosome conformation capture assays (3C-qPCR). Nature. 2 (7), 1722-1733 (2007).
- Anand, R. D., Sertil, O., Lowry, C. V. Restriction digestion monitors facilitate plasmid construction and PCR cloning. BioTechniques. 36 (6), 982-985 (2004).
- Afgan, E., et al. The Galaxy platform for accessible, reproducible and collaborative biomedical analyses: 2016 update. Nucleic acids research. 44 (W1), W3-W10 (2016).
- Li, H., Durbin, R. Fast and accurate long-read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics. 26 (5), 589-595 (2010).
- Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
- Walter, C., Schuetzmann, D., Rosenbauer, F., Dugas, M. Basic4Cseq: An R/Bioconductor package for analyzing 4C-seq data. Bioinformatics. 30 (22), 3268-3269 (2014).
- Raviram, R., et al. 4C-ker: A Method to Reproducibly Identify Genome-Wide Interactions Captured by 4C-Seq Experiments. PLoS Computational Biology. 12 (3), (2016).
- Klein, F. A., Pakozdi, T., Anders, S., Ghavi-helm, Y., Furlong, E. E. M., Huber, W. FourCSeq: analysis of 4C sequencing data. Bioinformatics. 31 (19), 3085-3091 (2015).
- Williams, R. L., et al. fourSig a method for determining chromosomal interactions in 4C-Seq data. Nucleic Acids Research. 42 (8), (2014).
- McLean, C. Y., et al. GREAT improves functional interpretation of cis-regulatory regions. Nature Biotechnology. 28 (5), 495-501 (2010).
- Stolzenburg, L. R., et al. Regulatory dynamics of 11p13 suggest a role for EHF in modifying CF lung disease severity. Nucleic Acids Research. 45 (15), 8773-8784 (2017).
- Meddens, C. A., et al. Systematic analysis of chromatin interactions at disease associated loci links novel candidate genes to inflammatory bowel disease. Genome Biology. 17 (1), 1-15 (2016).
- Yeung, J., et al. Transcription factor activity rhythms and tissue-specific chromatin interactions explain circadian gene expression across organs. Genome research. , 207787 (2017).
