Высок объём идентификации генов регулирования последовательностей с использованием следующего поколения последовательности круговой хромосома конформации захвата (4C-seq)
Summary
Выявление физических взаимодействий между генов и нормативных элементов сложной но способствовала хромосома конформации захвата методами. Эта модификация 4C-seq протокол смягчает ПЦР предвзятости, сведения к минимуму чрезмерного амплификации PCR шаблонов и максимально mappability чтений путем включения добавлением энзима ограничения дайджест шаг.
Abstract
Выявление нормативных элементов для заданного целевого гена представляет значительную техническую проблему ввиду изменчивости размеров позиционирования и эффект нормативных элементов целевого гена. Некоторый прогресс был достигнут с bioinformatic прогноз существования и функции проксимальной эпигеномные изменения, связанные с активированной гена выражением, с использованием сайтов связывания фактор транскрипции сохраняется. Хроматин конформации захвата исследования революционизировали нашу способность обнаружить физические хроматина контактов между последовательностями и даже в пределах всего генома. Круговой хроматина конформации захвата в сочетании с следующего поколения последовательности (4C-seq), в частности, предназначен для обнаружить все возможные физические хроматина взаимодействия для заданной последовательности интерес (точки зрения), например целевого гена или регулирования усилитель. Нынешние стратегии 4C-seq непосредственно последовательности от в пределах точки зрения, но требуют многочисленные и разнообразные точки зрения одновременно упорядочивать избежать технических проблем единой базы вызова (томография) с виртуализации платформ следующего поколения. Этот объем экспериментов не может быть практичным для многих лабораторий. Здесь мы приводим модифицированный подход к Протоколу 4C-seq, который включает в себя дополнительные энзима ограничения дайджест и шаги на основе ПЦР амплификации, которые предназначены для содействия большей захват последовательности различных чтений и уменьшить потенциал для ПЦР смещения, соответственно. Наш модифицированный метод 4C поддаются стандартным молекулярной биологии лаборатории для оценки архитектуры хроматина.
Introduction
В проекте Энциклопедия элементов ДНК (кодирования), всесторонне аннотированной функциональной активности для 80% генома человека1,2способствует выявление нормативных элементов для экспрессии генов. Определение участков в естественных условиях привязки фактор транскрипции, DNaseI Гиперчувствительность и эпигеномные гистона и изменения метилирования ДНК в типах отдельных клеток проложили путь для функционального анализа регулирования кандидата элементы для целевого выражения гена. Вооружившись этими выводами, мы сталкиваемся с проблемой определения функциональной взаимосвязи между регуляторных элементов и генов. В частности какова взаимосвязь между данной цели ген и его enhancer(s)? Метод capture (3C) конформации хроматина непосредственно решает этот вопрос выявления физических и вероятно, функциональных, взаимодействия между региона интерес и кандидат, взаимодействующих последовательности через события в фиксированных хроматина3 . Как наше понимание хроматина взаимодействий увеличилось, однако, становится ясно, что расследование предварительно кандидат локусов является недостаточным для обеспечения полного понимания взаимодействия генов усилитель. Например кодирования для изучения небольшую часть генома человека (1%, экспериментальный набор 44 локусов) использовался метод carbon copy (5C) захвата высок объём хромосомных конформации и сообщил сложные взаимосвязи локусов. Гены и усилители с выявленными взаимодействий в среднем 2 – 4 различные взаимодействия партнеров, многие из которых были сотни kilobases в линейное пространство4. Кроме того, Li и др. используется анализ взаимодействия Chromatin, сопряженные-конец тега виртуализации (ChIA-PET) для анализа состава геном промоутер взаимодействия и обнаружил, что 65% РНК-полимераза II привязки сайтов были вовлечены в хроматина взаимодействий. Некоторые из этих взаимодействий привели к большой, мульти гена комплексы, охватывающей сотни kilobases геномной расстояния и содержащий, в среднем, 8-9 генов каждый5. Вместе эти выводы подчеркивают необходимость объективной всего генома методы допроса хроматина взаимодействий. Рассматриваются некоторые из этих методов в Шмитт и др. 6.
Более последние методы хроматина конформации захват исследований в сочетании с следующего поколения виртуализации (Hi-C и 4C-seq) включить обнаружение неизвестных последовательностей, взаимодействующих с регионом интерес6. В частности, круговой хромосома конформации захвата с секвенирование нового поколения (4C-seq) была разработана для выявления локусов, взаимодействующих с последовательностью интерес к непредвзято7 по секвенированию ДНК из захваченных хроматина проксимальнее области интереса в трехмерном пространстве. Вкратце хроматина фиксируется для сохранения своей родной протеин дна взаимодействий, расщепляется с энзима ограничения и впоследствии лигируют разбавляют условиях захватить биологически соответствующих «связок» взаимодействующих локусов (рис. 1). Для удаления белка, таким образом оставляя для дополнительных расщепления ДНК с второй энзима ограничения отменяются перекрестные ссылки. Окончательный лигирование генерирует меньше круги взаимодействующих локусов. Праймеры для последовательности интерес затем используются для создания усиливается библиотека неизвестных последовательностей из circularized фрагментов, следуют ниже по течению следующего поколения последовательности.
Протокол, представленные здесь, который фокусируется на пробоподготовку, делает два основных изменения существующих 4C-seq методы8,9,10,,1112. Во-первых он использует метод на основе ПЦР эмпирически определить оптимальное количество усиления циклов для 4C-seq библиотека подготовительных шагов и таким образом снижает потенциал для ПЦР предвзятости, обусловленной чрезмерного усиления библиотек. Во-вторых он использует дополнительное ограничение дайджест шаг в попытке уменьшить единообразия известных «наживка» последовательности, что препятствует точной базы вызова последовательности документа и, следовательно, максимально уникальный, информативный последовательности в каждой операции чтения. Другие протоколы обойти эту проблему путем объединения многих библиотек 4 C-seq8 (12-15) с различными приманки последовательностей и/или ограничения сайтов, объем экспериментов, которые не могут быть достижимыми в других лабораториях. Изменения, представленные здесь допускается небольшое количество экспериментов, образцы, и/или реплицирует быть проиндексированы и объединили в одну полосу.
Protocol
Representative Results
Discussion
4C результаты имеют потенциал, чтобы выявить хроматина взаимодействий, которые могут идентифицировать неизвестные ранее регуляторных элементов и/или целевых генов, которые имеют важное значение в контексте конкретных биологических24,25,26<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана NIAMS (R01AR065523).
Materials
| HindIII | NEB | R0104S | |
| CviQI | NEB | R0639S | |
| DNA oligonucleotide primers | IDT | To be designed by the reader | |
| 50 mL conical centrifuge tubes | Fisher Scientific | 06-443-19 | |
| 1.7 mL microcentrifuge tubes | MidSci | AVSS1700 | |
| Phosphate buffered saline | Thermo Fisher | 14190-136 | |
| Formaldehyde, methanol free | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Nutator | VWR | 15172-203 | |
| Glycine | JT Baker | 4059-00 | |
| Benchtop centrifuge | |||
| Refrigerated microcentrifuge | |||
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | ED2SS | |
| 20% SDS solution | Sigma-Aldrich | 05030 | |
| Trypan Blue | Thermo Fisher | 15250061 | |
| Glass slides | Fisher Scientific | 12-550-143 | |
| Cover slips | VWR | 16004-094 | |
| Light microscope | |||
| Triton X-100 | Alfa Aesar | A16046 | |
| Shaking heat block | |||
| 2M Tris-HCl | Quality Biological | 351-048-101 | |
| Proteinase K | NEB | P8107S | |
| Phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1) | Sigma-Aldrich | P2069 | |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | M5661 | |
| 20 mg/mL glycogen | Thermo Fisher | R0561 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | 04-355-223 | |
| Nuclease-free water | Fisher Scientific | MT-46-000-CM | |
| qPCR cycler | Thermo Fisher | 4453536 | |
| qPCR plates | Thermo Fisher | 4309849 | |
| Thermocycler | Thermo Fisher | 4375786 | |
| PCR strip tubes | MidSci | AVSST-FL | |
| 1M Magnesium chloride | Quality Biological | 351-033-721 | |
| Dithiothreotol | Sigma-Aldrich | 43815 | |
| Adenosine triphosphate | Sigma-Aldrich | A2383 | |
| T4 DNA Ligase | NEB | M0202S | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A6013 | |
| RNase A | Thermo Fisher | EN0531 | |
| Qiaquick PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
| MinElute PCR Purification kit | Qiagen | 28004 | |
| Spectrophotometer | |||
| Expand Long Template PCR System | Sigma-Aldrich | 11681834001 | |
| dNTP mix | Thermo Fisher | R0191 | |
| SYBR Green I | Sigma-Aldrich | S9430 | |
| ROX | BioRad | 172-5858 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| End-It DNA End-Repair Kit | Lucigen | ER0720 | |
| LigaFast Rapid DNA Ligation System | Promega | M8221 | |
| SYBR Safe | Thermo Fisher | S33102 | |
| Taq Polymerase | NEB | M0267S | |
| UltraSieve Agarose | IBI Scientific | IB70054 | |
| Qiaquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 |
References
- Dunham, I., et al. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
- Hoffman, M. M., et al. Integrative annotation of chromatin elements from ENCODE data. Nucleic Acids Research. 41 (2), 827-841 (2013).
- Dekker, J., Rippe, K., Dekker, M., Kleckner, N. Capturing Chromosome Conformation. Science. 295 (5558), 1306-1311 (2002).
- Sanyal, A., Lajoie, B. R., Jain, G., Dekker, J. The long-range interaction landscape of gene promoters. Nature. 489 (7414), 109-113 (2012).
- Li, G., et al. Extensive promoter-centered chromatin interactions provide a topological basis for transcription regulation. Cell. 148 (1-2), 84-98 (2012).
- Schmitt, A. D., Hu, M., Ren, B. Genome-wide mapping and analysis of chromosome architecture. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (12), 743-755 (2016).
- Zhao, Z., et al. Circular chromosome conformation capture (4C) uncovers extensive networks of epigenetically regulated intra- and interchromosomal interactions. Nature genetics. 38 (11), 1341-1347 (2006).
- Splinter, E., de Wit, E., van de Werken, H. J. G., Klous, P., de Laat, W. Determining long-range chromatin interactions for selected genomic sites using 4C-seq technology: From fixation to computation. Methods. 58 (3), 221-230 (2012).
- Van De Werken, H. J. G., et al. 4C technology: Protocols and data analysis. Methods in Enzymology. 513, (2012).
- Brouwer, R. W. W., van den Hout, M. C. G. N., van IJcken, W. F. J., Soler, E., Stadhouders, R. Unbiased Interrogation of 3D Genome Topology Using Chromosome Conformation Capture Coupled to High-Throughput Sequencing (4C-Seq). Eukaryotic Transcriptional and Post-Transcriptional Gene Expression Regulation. , 199-220 (2017).
- Matelot, M., Noordermeer, D. Determination of High-Resolution 3D Chromatin Organization Using Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq). Polycomb Group Proteins: Methods and Protocols. , 223-241 (2016).
- Gheldof, N., Leleu, M., Noordermeer, D., Rougemont, J., Reymond, A. Detecting Long-Range Chromatin Interactions Using the Chromosome Conformation Capture Sequencing (4C-seq) Method. Gene Regulatory Networks: Methods and Protocols. , 211-225 (2012).
- Göndör, A., Rougier, C., Ohlsson, R. High-resolution circular chromosome conformation capture assay. Nature. 3 (2), 303-313 (2008).
- Hagège, H., et al. Quantitative analysis of chromosome conformation capture assays (3C-qPCR). Nature. 2 (7), 1722-1733 (2007).
- Anand, R. D., Sertil, O., Lowry, C. V. Restriction digestion monitors facilitate plasmid construction and PCR cloning. BioTechniques. 36 (6), 982-985 (2004).
- Afgan, E., et al. The Galaxy platform for accessible, reproducible and collaborative biomedical analyses: 2016 update. Nucleic acids research. 44 (W1), W3-W10 (2016).
- Li, H., Durbin, R. Fast and accurate long-read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics. 26 (5), 589-595 (2010).
- Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
- Walter, C., Schuetzmann, D., Rosenbauer, F., Dugas, M. Basic4Cseq: An R/Bioconductor package for analyzing 4C-seq data. Bioinformatics. 30 (22), 3268-3269 (2014).
- Raviram, R., et al. 4C-ker: A Method to Reproducibly Identify Genome-Wide Interactions Captured by 4C-Seq Experiments. PLoS Computational Biology. 12 (3), (2016).
- Klein, F. A., Pakozdi, T., Anders, S., Ghavi-helm, Y., Furlong, E. E. M., Huber, W. FourCSeq: analysis of 4C sequencing data. Bioinformatics. 31 (19), 3085-3091 (2015).
- Williams, R. L., et al. fourSig a method for determining chromosomal interactions in 4C-Seq data. Nucleic Acids Research. 42 (8), (2014).
- McLean, C. Y., et al. GREAT improves functional interpretation of cis-regulatory regions. Nature Biotechnology. 28 (5), 495-501 (2010).
- Stolzenburg, L. R., et al. Regulatory dynamics of 11p13 suggest a role for EHF in modifying CF lung disease severity. Nucleic Acids Research. 45 (15), 8773-8784 (2017).
- Meddens, C. A., et al. Systematic analysis of chromatin interactions at disease associated loci links novel candidate genes to inflammatory bowel disease. Genome Biology. 17 (1), 1-15 (2016).
- Yeung, J., et al. Transcription factor activity rhythms and tissue-specific chromatin interactions explain circadian gene expression across organs. Genome research. , 207787 (2017).
