परिपत्र गुणसूत्र अनुरूप कब्जा की अगली पीढ़ी के अनुक्रमण का उपयोग जीन विनियामक अनुक्रम का उच्च प्रवाह पहचान (4c-seq)
Summary
जीन और विनियामक तत्वों के बीच शारीरिक बातचीत की पहचान चुनौतीपूर्ण है लेकिन गुणसूत्र अनुरूप कब्जा तरीकों से सुविधा दी गई है । इस संशोधन के लिए 4c-seq प्रोटोकॉल पीसीआर टेम्पलेट्स के अधिक से अधिक प्रवर्धन कम से पीसीआर पूर्वाग्रह का शमन और एक अतिरिक्त प्रतिबंध एंजाइम डाइजेस्ट कदम शामिल करके पढ़ता की मैपर की अधिकतमता.
Abstract
एक दिया लक्ष्य जीन के लिए विनियामक तत्वों की पहचान एक महत्वपूर्ण तकनीकी एक लक्ष्य जीन के लिए नियामक तत्वों की स्थिति और प्रभाव आकार में परिवर्तनशीलता के कारण चुनौती बन गया है । कुछ प्रगति के अस्तित्व के bioinformatic भविष्यवाणी के साथ किया गया है और समीपस्थ epigenetic के साथ जुड़े संशोधनों के समारोह संरक्षित प्रतिलेखन कारक बंधन साइटों का उपयोग कर सक्रिय जीन अभिव्यक्ति. क्रोमेटिन रचना कब्जा अध्ययनों से हमारे अनुक्रम और यहां तक कि एक पूरे जीनोम के भीतर भौतिक क्रोमेटिन संपर्कों को खोजने की क्षमता में क्रांति ला दिया है । परिपत्र क्रोमेटिन अनुरूप कैद अगली पीढ़ी के अनुक्रमण के साथ युग्मित (4c-seq), विशेष रूप से, इस तरह के एक लक्ष्य जीन या एक विनियामक के रूप में ब्याज (दृष्टिकोण), के एक दिए गए अनुक्रम के लिए सभी संभव भौतिक क्रोमेटिन बातचीत खोजने के लिए बनाया गया है बढ़ाने. वर्तमान 4c-seq रणनीति सीधे दृष्टिकोण के भीतर से अनुक्रम लेकिन कई और विविध दृष्टिकोण की आवश्यकता के लिए एक साथ समान बेस कॉलिंग (इमेजिंग) के तकनीकी चुनौतियों से बचने के अनुक्रम अगली पीढ़ी sequencing प्लेटफार्मों के साथ । प्रयोगों की यह मात्रा कई प्रयोगशालाओं के लिए व्यावहारिक नहीं हो सकती है. यहां, हम 4c-seq प्रोटोकॉल है कि दोनों एक अतिरिक्त प्रतिबंध एंजाइम डाइजेस्ट और qPCR आधारित प्रवर्धन कदम है कि विविध अनुक्रम के एक अधिक से अधिक कब्जा करने की सुविधा के लिए डिज़ाइन कर रहे है शामिल करने के लिए एक संशोधित दृष्टिकोण की रिपोर्ट पढ़ता है और क्षमता के लिए कम पीसीआर पूर्वाग्रह, क्रमशः । हमारे संशोधित 4c विधि क्रोमेटिन वास्तुकला का आकलन करने के लिए मानक आणविक जीवविज्ञान प्रयोगशाला के लिए उत्तरदायी है.
Introduction
जीन अभिव्यक्ति के लिए विनियामक तत्वों की पहचान डीएनए तत्वों (सांकेतिक शब्दों में बदलना) परियोजना है कि मानव जीनोम1,2के ८०% के लिए व्यापक रूप से व्याख्या कार्यात्मक गतिविधि के विश्वकोश द्वारा सुविधा दी गई है । के लिए साइटों की पहचान vivo प्रतिलेखन कारक बाध्यकारी, DNaseI अतिसंवेदनशीलता, और epigenetic हिस्टोन और डीएनए मिथाइल संशोधन व्यक्तिगत सेल प्रकार में उंमीदवार विनियामक के कार्यात्मक विश्लेषण के लिए मार्ग प्रशस्त लक्ष्य जीन अभिव्यक्ति के लिए तत्वों । इन निष्कर्षों के साथ सशस्त्र, हम विनियामक तत्वों और जीन के बीच कार्यात्मक संपर्क निर्धारित करने की चुनौती के साथ सामना कर रहे हैं । विशेष रूप से, किसी दिए गए लक्ष्य जीन और उसके बढ़ाने (ओं) के बीच क्या संबंध है? क्रोमेटिन क्षेऽ कैप्चर (3 सी) विधि सीधे इस प्रश्न के पते की पहचान करके शारीरिक, और संभावना कार्यात्मक, ब्याज और उंमीदवार के क्षेत्र के बीच बातचीत तय क्रोमेटिन 3 में छीना घटनाओं के माध्यम से बातचीत अनुक्रम . जैसे-जैसे क्रोमेटिन बातचीत की हमारी समझ बढ़ गई है, तथापि, यह स्पष्ट है कि चयनित उंमीदवार loci की जांच जीन बढ़ाने वाली बातचीत की पूरी समझ प्रदान करने के लिए अपर्याप्त है । उदाहरण के लिए, सांकेतिक शब्दों में बदलना उच्च प्रवाह गुणसूत्र अनुरूप कब्जा कार्बन कॉपी (5C) विधि मानव जीनोम के एक छोटे से हिस्से की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया (1%, ४४ loci के पायलट सेट) और loci के जटिल संपर्क की सूचना दी । जीन और बढ़ाने की पहचान की बातचीत के साथ 2 औसत-4 अलग बातचीत भागीदारों, जिनमें से कई थे kilobases के सैकड़ों दूर रैखिक अंतरिक्ष4में । इसके अलावा, ली एट अल। प्रयुक्त क्रोमेटिन बातचीत विश्लेषण द्वारा युग्मित अंत टैग अनुक्रमण (चिया-पीईटी) पूरे जीनोम प्रमोटर बातचीत का विश्लेषण करने के लिए और पाया कि आरएनए पोलीमरेज़ द्वितीय बाध्यकारी साइटों की ६५% क्रोमेटिन बातचीत में शामिल थे । इन बातचीत के कुछ बड़े, बहु जीन परिसरों जीनोमिक दूरी के kilobases के सैकड़ों फैले और युक्त, औसतन, 8-9 जीन प्रत्येक5में हुई । साथ में, इन निष्कर्षों क्रोमेटिन बातचीत पूछताछ के लिए निष्पक्ष पूरे जीनोम तरीकों की जरूरत पर प्रकाश डाला । इन तरीकों में से कुछ Schmitt एट अलमें समीक्षा कर रहे हैं । 6.
क्रोमेटिन अनुरूप कब्जा अध्ययन के लिए और अधिक हाल के तरीकों अगली पीढ़ी के अनुक्रमण के साथ युग्मित (Hi-C और 4c-seq) अज्ञात अनुक्रम के हित6के एक क्षेत्र के साथ बातचीत की खोज को सक्षम करें । विशेष रूप से, अगली पीढ़ी के अनुक्रमण के साथ परिपत्र गुणसूत्र अनुरूप कब्जा (4c-seq) पर कब्जा कर लिया क्रोमेटिन समीपस्थ से अनुक्रमण डीएनए द्वारा एक निष्पक्ष तरीके से7 में ब्याज की एक अनुक्रम के साथ बातचीत loci की पहचान करने के लिए विकसित किया गया था 3 डी अंतरिक्ष में रुचि के क्षेत्र । संक्षेप में, क्रोमेटिन अपने मूल प्रोटीन-डीएनए बातचीत, एक प्रतिबंध एंजाइम के साथ सट के संरक्षण के लिए तय हो गई है, और बाद में ligated शर्तों को पतला करने के लिए loci बातचीत के “(चित्रा 1) के साथ जैविक रूप से प्रासंगिक” पेचीदा कब्जा । क्रॉस लिंक के लिए प्रोटीन हटाने उलट रहे हैं, इस प्रकार एक दूसरे प्रतिबंध एंजाइम के साथ अतिरिक्त दरार के लिए उपलब्ध डीएनए छोड़ । एक अंतिम बंधाव loci बातचीत के छोटे हलकों उत्पंन करता है । ब्याज के अनुक्रम के लिए प्राइमरों तो परिपत्र विखंडित से अज्ञात दृश्यों की एक परिवर्धित पुस्तकालय उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं, बहाव अगली पीढ़ी अनुक्रमण द्वारा पीछा किया ।
प्रोटोकॉल यहां प्रस्तुत है, जो नमूना तैयारी पर केंद्रित है, दो प्रमुख परिवर्तन करने के लिए मौजूदा 4c-seq तरीकों8,9,10,11,12बनाता है । सबसे पहले, यह एक qPCR आधारित विधि का उपयोग करता है empirically के लिए प्रवर्धन चक्र की इष्टतम संख्या का निर्धारण 4c-seq पुस्तकालय तैयारी कदम है और इस तरह के लिए क्षमता का शमन पीसीआर पूर्वाग्रह पुस्तकालयों के अधिक से अधिक प्रवर्धन से उपजी । दूसरा, यह एक अतिरिक्त प्रतिबंध का उपयोग करता है एक के लिए जाना जाता “चारा” दृश्यों की एकरूपता को कम करने के प्रयास में कदम डाइजेस्ट कि सटीक आधार-बुला अनुक्रमण साधन द्वारा और, इसलिए, प्रत्येक पढ़ा में अद्वितीय, जानकारीपूर्ण अनुक्रम अधिकतम । अंय प्रोटोकॉल कई (12-15)8 विभिंन चारा अनुक्रम और/या प्रतिबंध साइटों, जो अंय प्रयोगशालाओं द्वारा प्राप्त नहीं किया जा सकता है की एक मात्रा के साथ 4c seq पुस्तकालयों पूलिंग द्वारा इस मुद्दे को दरकिनार । संशोधनों यहां प्रस्तुत प्रयोगों, नमूनों की एक छोटी संख्या की अनुमति है, और/या दोहराने के लिए एक ही गली में अनुक्रमित और परित ।
Protocol
Representative Results
Discussion
4c परिणाम क्रोमेटिन बातचीत है कि पहले से अज्ञात नियामक तत्वों और/या लक्ष्य जीन है कि एक विशिष्ट जैविक संदर्भ में महत्वपूर्ण है की पहचान कर सकते है प्रकट करने की क्षमता है24,25,<sup class…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को NIAMS (R01AR065523) ने सपोर्ट किया था ।
Materials
| HindIII | NEB | R0104S | |
| CviQI | NEB | R0639S | |
| DNA oligonucleotide primers | IDT | To be designed by the reader | |
| 50 mL conical centrifuge tubes | Fisher Scientific | 06-443-19 | |
| 1.7 mL microcentrifuge tubes | MidSci | AVSS1700 | |
| Phosphate buffered saline | Thermo Fisher | 14190-136 | |
| Formaldehyde, methanol free | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Nutator | VWR | 15172-203 | |
| Glycine | JT Baker | 4059-00 | |
| Benchtop centrifuge | |||
| Refrigerated microcentrifuge | |||
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | ED2SS | |
| 20% SDS solution | Sigma-Aldrich | 05030 | |
| Trypan Blue | Thermo Fisher | 15250061 | |
| Glass slides | Fisher Scientific | 12-550-143 | |
| Cover slips | VWR | 16004-094 | |
| Light microscope | |||
| Triton X-100 | Alfa Aesar | A16046 | |
| Shaking heat block | |||
| 2M Tris-HCl | Quality Biological | 351-048-101 | |
| Proteinase K | NEB | P8107S | |
| Phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1) | Sigma-Aldrich | P2069 | |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | M5661 | |
| 20 mg/mL glycogen | Thermo Fisher | R0561 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | 04-355-223 | |
| Nuclease-free water | Fisher Scientific | MT-46-000-CM | |
| qPCR cycler | Thermo Fisher | 4453536 | |
| qPCR plates | Thermo Fisher | 4309849 | |
| Thermocycler | Thermo Fisher | 4375786 | |
| PCR strip tubes | MidSci | AVSST-FL | |
| 1M Magnesium chloride | Quality Biological | 351-033-721 | |
| Dithiothreotol | Sigma-Aldrich | 43815 | |
| Adenosine triphosphate | Sigma-Aldrich | A2383 | |
| T4 DNA Ligase | NEB | M0202S | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A6013 | |
| RNase A | Thermo Fisher | EN0531 | |
| Qiaquick PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
| MinElute PCR Purification kit | Qiagen | 28004 | |
| Spectrophotometer | |||
| Expand Long Template PCR System | Sigma-Aldrich | 11681834001 | |
| dNTP mix | Thermo Fisher | R0191 | |
| SYBR Green I | Sigma-Aldrich | S9430 | |
| ROX | BioRad | 172-5858 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| End-It DNA End-Repair Kit | Lucigen | ER0720 | |
| LigaFast Rapid DNA Ligation System | Promega | M8221 | |
| SYBR Safe | Thermo Fisher | S33102 | |
| Taq Polymerase | NEB | M0267S | |
| UltraSieve Agarose | IBI Scientific | IB70054 | |
| Qiaquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 |
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