טולדין כחול מכתים סעיפים שרף-מוטבע להערכת המורפולוגיה במערכת העצבים ההיקפית
Summary
כאן אנו מציגים פרוטוקול להמחיש ומבנים של העצבים ההיקפיים על ידי קבלת מכתימה את סעיפים 1-2 מיקרומטר עם טולדין כחול
Abstract
העצבים ההיקפיים להרחיב בכל הגוף, innervating ברקמות היעד עם אקסונים מוטוריים או חושית. עקב הפצה נרחבת, העצבים ההיקפיים נפגעים לעתים קרובות בגלל טראומה או מחלה. כמו שיטות ואסטרטגיות פותחו כדי להעריך את הפגיעה במערכת העצבים ההיקפית במודלים של בעלי חיים, הפונקציה והתחדשות, לנתח את morphometry של עצב היקפי הפך מדידה תוצאה מסוף חיוני. מקטעים טולדין כחול צביעה של עצב קרוס שהושג ממקטעים עצב שרף מוטבע הוא שיטה ישימה עבור הערכות כמותיים של העצבים ההיקפיים, המאפשר ויזואליזציה של מורפולוגיה מספר אקסונים ומידת myelination. טכניקה זו, כמו עם שיטות היסטולוגית רבות אחרות, יכול להיות קשה כדי ללמוד ולעבוד באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים בכתב. הכוונה של פרסום זה לכן כדי להדגיש פרוטוקולים בכתב עבור טולדין כחול צביעה של העצבים ההיקפיים עם צילום וידאו של השיטה, באמצעות העצבים ממוגלה שנקטפו חולדות. ב פרוטוקול זה, אנו מתארים ויוו עצבים היקפית קיבוע ואוסף של רקמות, וכן קיבוע שאחרי עם 2% אוסמיום ארבע-חמצני, הטבעה של עצבים שרף אפוקסי, ultramicrotome חלוקתה של עצבים עד עובי 1-2μm. עצב חלקים לאחר מכן הועבר זכוכית, מוכתם כחול טולדין, אחרי אשר הם נמצאים באופן כמותי ובאופיו העריך. דוגמאות הבעיות הנפוצות ביותר מוצגות, כמו גם צעדים להקלת בנושאים אלה.
Introduction
העצבים ההיקפיים להרחיב בכל הגוף, innervating ברקמות היעד עם אקסונים מוטוריים או חושי1. ליקויים במערכת העצבים ההיקפית הנגרמת על ידי הפרעות רפואיות, טראומה מייצגים בעיה מרכזית בבריאות הציבור ויש השפעות כלכליות גדולות2,3. למרות ההתקדמות הערכת התוצאות של פגיעות במערכת העצבים ההיקפית והבנה התחדשות עצבים, שיטות מסורתיות כגון עצב היסטולוגיה וצביעת טכניקות הן כלי חשוב להעריך איכותית, באופן כמותי עצב בריאות כמידה התוצאה מסוף חייתיים או רקמה אנושית נכרת. זה לעתים קרובות מזווג עם מדידות אלקטרופיזיולוגיות של פונקציה במערכת העצבים ההיקפית, איפה morphometry יכול לגלות למה עצב פונקציונליים התחדשות עשה או לא התרחשה.
טולדין כחול מכתים סעיפים שרף מוטבע למחצה דק במערכת העצבים ההיקפית היא שיטה מיוחדת הדמיה סיבי העצב סיבי עצב, אספקת באיכות גבוהה ונקה תמונות מפורט של עצב מבנים4,5,6 . טולדין הכחולה הכתם metachromatic acidophilic, התגלה על ידי ויליאם הנרי מין הולל ב- 1856-7, כבר בשימוש ביישומים רפואיים מספר8. טולדין blue מוכתמת במערכת העצבים ההיקפית מקטעים המתקבל מקטעי עצב שרף-מוטבע מאפשר הדמיה ברורה של עצב מבנים. הדמיה של מבנה המיאלין יכול להיות מוגברת על ידי השימוש אוסמיום ארבע-חמצני קיבוע שאחרי4,9. אוסמיום ארבע-חמצני הוא רעיל חמצון של שומנים בדם מקבע סוכן המקיים אינטראקציה עם קשרים כפולים בשומנים, וכתוצאה מכך וליישובים מוגדר השומנים-עשיר המיאלין מעילי פרווה10 עם זאת, אוסמיום ארבע-חמצני רעיל, יקר, דורש של דגירה ארוך יותר של מקטעים עצב, הוא לא תמיד.
שיטות אלטרנטיביות של עיבוד, צביעת פותחו עבור ויזואליזציה של מורפולוגיה במערכת העצבים ההיקפית; פרפין חלוקתה קריוגני, אפוקסי שרף-מוטבע עצב חלוקתה ואחריו מכתים עם טולדין כחול או פתרון phenylenediamine שימש לכמת שינויים מורפולוגיים במערכת העצבים ההיקפית התחדשות 11,12 . שיטות אלה כל יש יתרונות שלהם ועל הנתונים החיוניים התשואה על מספר אקסונים, עובי המיאלין, קוטר האקסון, קוטר האקסון סיבים סיבי העצב קוטר (g-יחס) 11,13,14,15 .
ההבחנה העיקרית שרף-הטבעה של פרוטוקול זה הוא כי הוא מקל קבלת חתכים עובי של 1-2 μm בשל הקושי של השרף תוך שמירה על התכונות היסטולוגית של העצב. סעיפים אלה דק, בניגוד הסעיפים עובי μm 4-5 המתקבל פרפין הטבעה, לספק במערכת העצבים ההיקפית מקטעים עם רזולוציה גבוהה יותר, ומאפשר כימות מדויקת יותר של האקסון myelination, כגון g-היחס, זה לא יכול להיות להשיג חלקים עבה16. בזמן ההקפאה חלוקתה יכול לשמש כדי להשיג את סעיפים 1-2 מיקרומטר, עברו את החוויה שלנו כי קשה יותר להשיג חלקים ללא סדקים גדולים רבים. קטעים סדוק כאלה יכולים לגרום ספירה מדויקת של המספר של אקסונים והיבטים של myelination.
בנוסף טולדין כחול מכתים17, כסף מכתים שיטת18 ומאסון מוכתמים trichrome4 יכול לשמש גם להראות אומץ אקסונים. עם זאת, באמצעות שרף הטמעת סעיפים עצב התווך עכברוש מוכתם או hematoxylin אאוזין או מאסון trichrome עטיפות המיאלין הראה חלש ו מבנים לא מזוהה, ואילו טולדין כחול מכתים הראו תמונה ברורה מעטפת המיאלין והוא יכול בקלות להיות כימות4. למרות מספר מגבלות, העצבים טולדין כחול מכתים של שרף מוטבע היקפית היא טכניקה יקר יכול לשמש כאשר תמונות ברזולוציה גבוהה של עצב מורפולוגיה נדרשים.
החיסרון העיקרי להטבעת שרף הוא כי זה זמן רב, אינו מאפשר immunostaining של הרקמה אותו בשל הקושי של אנטיגן אחזור בהשוואה פרפין וטכניקות מקטעים מוטבע קפוא. לכן לא לרוב ניתן לנצל את הרקמה זהה עבור immunostaining שמעובד באמצעות שרף-הטבעה על צביעת טולדין כחול. אמנם לא היה כאן, אם אימונוהיסטוכימיה רצוי שרף מקטעים מוטבע, השימוש methacrylate גליקול הטבעה שרפים מאפשר אימונוהיסטוכימיה להתבצע על מקטעי רקמת, אבל זה יקרה יחסית19. זה יכול להיות מעט חמאני חיתוך העצב ההיקפי לתוך מקטעים נפרדים, חלקם להטבעת שרף ואחרים עבור immunostaining ישירות לאחר קיבוע.
התהליך של טולדין כחול צביעה של שרף מוטבע העצבים ההיקפיים, כמו עם ניתוח histopathological ביותר, יכול להיות שבור לתוך חמישה שלבים, כולל קיבוע, התייבשות, הטבעה, חלוקתה, צביעת20. אנו שואפים כאן מספקים פרוטוקול ו מנחה מעשית לשימוש בשרף עכברוש מוטבע בעצב סעיפים מוכתמים טולדין כחול לרכוש תמונות באיכות גבוהה.
Protocol
Representative Results
Discussion
בדיקות של המבנים מורפולוגי של פגיעה במערכת העצבים ההיקפית והתחדשות הינם נושאים תכופים של המחקר13. ב פרוטוקול זה, אנו מתארים את השלבים כדי להשיג תמונות באיכות גבוהה עבור נתונים היסטולוגית quantifications באמצעות רקמות בעצב חולדה בתוך גושי שרף, מוכתם טולדין כחול. טכניקה זו מספקת תמונה …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים רוצה thankthe ג’נקינס מיקרוסקופ מתקן אוניברסיטת ויומינג לעזרתם, חברי המעבדה הבושמנית, קלי Roballo, נכון היידן, Wupu Osimanjiang, וסובאש Dhunghana, סיוע בטיפול בבעלי חיים. פרסום זה התאפשרה על ידי פרס פיתוח מוסדיים (מושג) מ הלאומית המכון כללי רפואי למדעים של מכוני הבריאות הלאומיים תחת גרנט # 2P20GM103432.
Materials
| Dulbecco's Phosphate Buffer Saline | Gibco | 14200-075 | |
| Glutaraldehyde Solution | Sigma-Aldrich | G6257 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| Toluidine Blue O | Sigma-Aldrich | T3260 | |
| Sodium Tetraborate Decahydrate | Acros Organics | 205950010 | |
| Isoflurane | Piramal | NDC 66794-013-25 | |
| Epoxy Embedding Medium Kit | Sigma-Aldrich | 45359 | |
| Sodium Hydroxide Solution | Sigma-Aldrich | 72068 | To adjust Trump's fixative pH |
| Acetone | Fisher Chemical | 170942 | |
| Osmium Tetroxide Solution | Sigma-Aldrich | 75632 | |
| VWR Micro Slides, Superfrost Plus | VWR | 48311-703 | |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12545102 | |
| Pelco Embedding Cast | Fisher Scientific | NC9671811 | |
| Glass Knife Maker | RMC Products | GKM-2 | |
| Ultramicrotome | RMC Products | MT-XL | |
| 15 mL Conical Tube | Falcon | ISO 9001 | |
| Eppendorf 1.5 mL microcentrifuge tubes | Sigma-Aldrich | T9661 | |
| 4 mL Glass Vial | Sigma-Aldrich | 854190 | |
| Razor Blades | VWR | 55411-050 | For trimming resin block |
| Perfect Loop | Electron Microscopy Sciences | 70944 | For picking up thin resin sections |
| Ultra Glass Knife Strips 6.4 mm x 25 mm x 400 mm | Electron Microscopy Sciences | 71012 | |
| 100 Watt Oven | Millipore | 6350115 | |
| Whatman Filter Paper | Sigma-Aldrich | WHA10010155 | |
| 3 mL plastic pipette | Sigma-Aldrich | Z331740 | |
| Micro-surgical Kit | World precision instruments | ||
| Olympus fluorescence microscope | Dual CCD Color and Monochrome Camera, DP80 |
References
- Zacchigna, S., Ruiz de Almodovar, C., Carmeliet, P. Similarities between angiogenesis and neural development: What small animal models can tell us. Current Topics in Developmental Biology. 80, 1-55 (2008).
- Grinsell, D., Keating, C. P. Peripheral nerve reconstruction after injury: A review of clinical and experimental therapies. BioMed Research International. 2014, 1-13 (2014).
- Chen, M. B., Zhang, F., Lineaweaver, W. C. Luminal fillers in nerve conduits for peripheral nerve repair. Annals of Plastic Surgery. 57 (4), 462-471 (2006).
- Scipio, F., Raimondo, S., Tos, P., Geuna, S. A simple protocol for paraffin-embedded myelin sheath staining with osmium tetroxide for light microscope observation. Microscopy Research and Technique. 71, 497-502 (2008).
- Raimondo, S., Fornaro, M., Di Scipio, F., Ronchi, G., Giacobini-Robecchi, M. G., Geuna, S. Chapter 5: Methods and protocols in peripheral nerve regeneration experimental research: part II-morphological techniques. International Review of Neurobioly. 87, 81-103 (2009).
- Carriel, V., Garzon, I., Alaminos, M., Campos, A. Evaluation of myelin sheath and collagen reorganization pattern in a model of peripheral nerve regeneration using an integrated histochemical approach. Histochemistry and Cell Biology. , 709-717 (2011).
- Sridharan, G., Shankar, A. A. Toluidine blue: A review of its chemistry and clinical utility. Journal of Oral and Maxillofacial Pathology. 16, 251-255 (2012).
- Epstein, J. B., Scully, C., Spinelli, J. Toluidine blue and Lugol’s iodine application in the assessment of oral malignant disease and lesions at risk of malignancy. Journal of Oral Pathology & Medicine. 21, 160-163 (1992).
- Carriel, V., Garzon, I., Alaminos, M., Cornelissen, M. Histological assessment in peripheral nerve tissue engineering. Neural Regeneration Research. 9, 1657-1660 (2014).
- Dykstra, M. J. . A manual of applied techniques for biological electron microscopy. , 257 (1993).
- Vleggeert-Lankamp, C. L. The role of evaluation methods in the assessment of peripheral nerve regeneration through synthetic conduits: A systematic review. Journal of Neurosurgery. 107 (6), 1168-1189 (2007).
- Williams, P., Wendell-Smith, C. P., Finch, A., Stevens, G. Further uses and methods of processing of fresh frozen sections of peripheral nerve. Journal of Cell Science. 3 (69), 99-105 (1964).
- Castro, J., Negredo, P., Avendaño, C. Fiber composition of the rat sciatic nerve and its modification during regeneration through a sieve electrode. Brain research. , 65-77 (2008).
- Raimondo, S., Fornaro, M., Di Scipio, F., Ronchi, G., Giacobini-Robecchi, M. G., Geuna, S. Methods and protocols in peripheral nerve regeneration experimental research: Part II-morphological techniques. International review of neurobiology. 87, 81-103 (2009).
- Bozkurt, A., Lassner, F., O’Dey, D., Deumens, R., Böcker, A., Schwendt, T., Janzen, C., Suschek, C. V., Tolba, R., Kobayashi, E., Sellhaus, B. The role of microstructured and interconnected pore channels in a collagen-based nerve guide on axonal regeneration in peripheral nerves. Biomaterials. 33 (5), 1363-1375 (2012).
- Weis, J., Brandner, S., Lammens, M., Sommer, C., Vallat, J. M. Processing of nerve biopsies: A practical guide for neuropathologists. Clinical Neuropathology. 31 (1), 7-23 (2012).
- Battiston, B., Tos, P., Geuna, S., Giacobini-Robecchi, M. G., Guglielmone, R. Nerve repair by means of vein filled with muscle grafts. II. Morphological analysis of regeneration. Microsurgery. 20 (1), 37-41 (2000).
- Bhattacharyya, T. K., Thomas, J. R. Comparison of staining methods for resin-embedded peripheral nerve. Journal of Histotechnology. 27, 161-164 (2004).
- Zbaeren, J., Zbaeren-Colbourn, D., Haeberli, A. High-resolution immunohistochemistry on improved glycol methacrylate-resin sections. Journal of Histotechnology. 30 (1), 27-33 (2007).
- Alturkistani, H. A., Tashkandi, F. M., Mohammedsaleh, Z. M. Histological stains: A literature review and case study. Global Journal of Health Science. 8 (3), 72-79 (2016).
- Ezra, M., Bushman, J., Shreiber, D., Schachner, M., Kohn, J. Porous and nonporous nerve conduits: the effects of a hydrogel luminal filler with and without a neurite-promoting moiety. Tissue Engineering Part A. (9-10), 818-826 (2016).
- Bhatnagar, D., Bushman, J. S., Murthy, N. S., Merolli, A., Kaplan, H. M., Kohn, J. Fibrin glue as a stabilization strategy in peripheral nerve repair when using porous nerve guidance conduits. Journal of Materials Science: Materials in Medicine. 28 (5), 79 (2017).
