甲苯胺蓝染色树脂嵌段评价周围神经形态学
Summary
在这里, 我们提出了一个通过获取和染色1-2 µm 段与甲苯胺蓝可视化周围神经精细结构的协议
Abstract
周围神经延伸整个身体, 支配靶组织与马达或感觉轴突。由于广泛的分布, 周围神经经常因外伤或疾病而受损。由于对周围神经损伤的动物模型、功能和再生方法和策略进行了评估, 分析周围神经的形态计量已成为一个重要的终端结果测量。甲苯胺蓝染色神经横断面从树脂嵌入神经切片是一种重现性的方法, 定性和定量评估周围神经, 使可视化的形态学数字的轴突和程度髓鞘形成.这项技术, 和其他许多组织学方法一样, 很难用标准的书面协议来学习和掌握。因此, 本出版物的目的是强调书面协议, 以甲苯胺蓝染色的周围神经与录像的方法, 利用从大鼠的坐骨神经。在本协议中, 我们描述了在体外周神经固定和组织收集, 并后固定与2% 锇毒气, 嵌入神经在环氧树脂, ultramicrotome 切片的神经1-2μm 厚度。神经部分然后转移到玻璃滑动和染甲苯胺蓝色, 在之后他们定量地和定性地被评估。显示了最常见问题的例子, 以及缓解这些问题的步骤。
Introduction
周围神经延伸整个身体, 支配靶组织与马达或感觉轴突1。由医疗失调和外伤引起的周围神经缺损是一个重大的公共卫生问题, 对2、3的经济影响很大。尽管评估周围神经损伤的结果和了解神经再生的进展, 传统的方法, 如神经组织学和染色技术是定性和定量评估神经健康的基本工具作为最终的结果测量动物模型或切除人体组织。这通常与周围神经功能的电生理测量成配对, 在那里, 形态计量学可以揭示功能性神经再生的原因或没有发生。
甲苯胺蓝染色的树脂嵌入半薄外围神经切片是一种专门的方法, 以成像髓神经纤维, 提供高质量和清晰的详细图像的神经结构4,5,6.甲苯胺蓝是一个耐热 metachromatic 染色, 发现的威廉亨利珀在 1856年7, 并已用于几个医疗应用8。甲苯胺蓝染色的周围神经部分获得的树脂嵌入神经段允许清晰的可视化神经结构。使用锇毒气后固定4,9可增强髓鞘结构的可视化。锇毒气是一种有毒的氧化剂和脂质固定剂, 与脂质中的双键相互作用, 导致了明显的富含脂质的髓鞘10。然而, 锇毒气是有毒的, 昂贵的, 需要更长的神经段的孵化, 并不总是使用。
对周围神经形态学的可视化处理和染色方法进行了研究;石蜡, 低温切片, 环氧树脂嵌入神经切片后, 以甲苯胺蓝或苯二胺溶液染色, 用于定量测定周围神经再生11,12 的形态学变化..这些方法各自有各自的优势和产生的关键数据的轴突, 髓鞘厚度, 轴突直径, 轴突直径髓纤维直径 (g 比) 11,13,14,15.
该协议中的树脂嵌入的主要区别是它促进获得1-2 微米厚度剖面由于树脂的硬度, 同时保持神经的组织学质量。这些稀薄的部分, 相对于从石蜡嵌入获得的4-5 微米厚度部分, 提供了更高的分辨率的外围神经部分, 允许更准确的量化轴突髓鞘形成, 如 g 比, 这不能从较厚的部分16获得。虽然低温切片可用于获得1-2 µm 剖面, 但我们的经验是, 很难获得部分没有大量的大裂缝。这些破裂的部分可能导致不准确计数的轴突的数量和方面的髓鞘形成。
除了甲苯胺蓝染色17, 银染色法18和马尾松的三色染色4也可以用来显示神经轴突。然而, 使用树脂嵌入的大鼠中位神经切片染色的苏木精和三色或马尾的, 显示微弱的髓鞘和无法识别的结构, 而甲苯胺蓝染色显示明确的髓鞘图像, 容易能够量化4。尽管有一定的局限性, 甲苯胺蓝染色的树脂嵌入周围神经是一个宝贵的技术, 可用于当高分辨率图像的神经形态学需要。
树脂嵌入的主要缺点是它是费时的, 并且不允许同一个组织的染色由于抗原检索的困难与石蜡和被冻结的嵌入的部分技术相比。因此, 一般不可能利用相同的组织为染色, 通过树脂嵌入处理甲苯胺蓝染色。虽然在这里不使用, 如果在树脂嵌入部分需要免疫组化, 使用乙二醇甲基丙烯酸酯嵌入树脂允许免疫组化在组织切片, 但它是相对昂贵的19。这可以通过将周围神经分割成分开的部分来减轻, 有些用于植入树脂, 或者在固定后直接染色。
甲苯胺蓝染色的树脂嵌入周围神经的过程, 如大多数病理学分析, 可分为五个阶段, 包括固定, 脱水, 植入, 切片, 染色20。本实验旨在为应用树脂嵌入甲苯胺蓝染色的大鼠坐骨神经切片提供一种实用的方案和实践指导, 以获得高质量的图像。
Protocol
Representative Results
Discussion
对周围神经损伤和再生的形态学结构的检查是研究的13个经常科目。在本协议中, 我们描述了获取高品质图像的步骤, quantifications 利用大鼠坐骨神经组织嵌入树脂块和染色甲苯胺蓝的组织学数据。该技术提供了一种神经形态学的图像, 可以通过测量轴突数、髓鞘形成程度、浸润性纤维化组织的存在和健康神经来量化神经再生。虽然图像显示切片和处理未受伤的神经作为样本, 同样?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者希望 thankthe 詹金斯显微镜设施在怀俄明大学为他们的帮助, 并且布什曼实验室的成员, 凯利 Roballo, 海登真实, Wupu Osimanjiang 并且 Subash Dhunghana, 为动物关心的协助。这份出版物是由国立卫生研究院国立医学研究院的一个机构发展奖 (2P20GM103432) 授予的。
Materials
| Dulbecco's Phosphate Buffer Saline | Gibco | 14200-075 | |
| Glutaraldehyde Solution | Sigma-Aldrich | G6257 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| Toluidine Blue O | Sigma-Aldrich | T3260 | |
| Sodium Tetraborate Decahydrate | Acros Organics | 205950010 | |
| Isoflurane | Piramal | NDC 66794-013-25 | |
| Epoxy Embedding Medium Kit | Sigma-Aldrich | 45359 | |
| Sodium Hydroxide Solution | Sigma-Aldrich | 72068 | To adjust Trump's fixative pH |
| Acetone | Fisher Chemical | 170942 | |
| Osmium Tetroxide Solution | Sigma-Aldrich | 75632 | |
| VWR Micro Slides, Superfrost Plus | VWR | 48311-703 | |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12545102 | |
| Pelco Embedding Cast | Fisher Scientific | NC9671811 | |
| Glass Knife Maker | RMC Products | GKM-2 | |
| Ultramicrotome | RMC Products | MT-XL | |
| 15 mL Conical Tube | Falcon | ISO 9001 | |
| Eppendorf 1.5 mL microcentrifuge tubes | Sigma-Aldrich | T9661 | |
| 4 mL Glass Vial | Sigma-Aldrich | 854190 | |
| Razor Blades | VWR | 55411-050 | For trimming resin block |
| Perfect Loop | Electron Microscopy Sciences | 70944 | For picking up thin resin sections |
| Ultra Glass Knife Strips 6.4 mm x 25 mm x 400 mm | Electron Microscopy Sciences | 71012 | |
| 100 Watt Oven | Millipore | 6350115 | |
| Whatman Filter Paper | Sigma-Aldrich | WHA10010155 | |
| 3 mL plastic pipette | Sigma-Aldrich | Z331740 | |
| Micro-surgical Kit | World precision instruments | ||
| Olympus fluorescence microscope | Dual CCD Color and Monochrome Camera, DP80 |
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