トルイジン ブルー染色樹脂埋め込まれたセクションの末梢神経形態の評価
Summary
ここで紹介を取得し、青いトルイジン 1-2 μ m のセクションを染色によって末梢神経の微細構造を可視化するためのプロトコル
Abstract
全身の運動や知覚神経軸索と標的組織を支配する末梢神経を拡張します。広範な分布のため末梢神経は、頻繁に外傷や疾患のため破損しています。メソッドと戦略は、動物モデル、機能と再生、末梢神経損傷を評価するために開発されていると末梢神経の形態学的分析重要なターミナルの結果測定になりました。樹脂埋め込み神経セクションからトルイジン ブルー クロス神経の染色切片は末梢神経、神経軸索の形態数と性の可視化を有効にすることの定性的および定量的な評価のための再現可能な方法髄鞘形成。この手法は、他の多くの組織学的方法と同様できます学び、標準的な文書によるプロトコルの使い方をマスターすることは困難。この文書の目的は、トルイジン ブルー坐骨神経ラットから収穫を使用して、メソッドのビデオ撮影と末梢神経の染色の文書によるプロトコルを強調するためにためです。末梢神経生体内固定と組織と四酸化オスミウム 2%、後固定のコレクションを述べるこのプロトコルでは、エポキシ樹脂とウルトラミクロトーム区分 1-2 μ m の厚さに神経の神経の埋め込み。神経節は、スライド ガラスに転送し、トルイジン青、その後彼らは、量的そして質的評価で染色します。これらの問題を軽減するための手順だけでなく、最も一般的な問題の例を示します。
Introduction
全身運動や感覚軸索1ターゲット組織を支配する末梢神経を拡張します。医学的障害によって引き起こされる末梢神経障害と外傷は主要な公衆衛生問題し大きな経済的影響2,の3を持っています。末梢神経損傷の結果を評価し、神経再生の理解の進歩にもかかわらず従来の神経組織や染色技術など、定性的・定量的評価神経の健康に不可欠なツール動物モデルやひと摘出組織のターミナルの結果測定。これはしばしば機能的な神経再生が発生しなかったかなぜ形態が明らかにできる末梢神経機能の電気生理学的測定とペアリングされています。
トルイジン ブルー染色樹脂埋め込まれている末梢神経の半薄いセクションの有髄神経線維、高品質を提供することをイメージングのための特殊なメソッドし、神経構造4,5,6 の詳細な画像をクリア.トルイジン ブルーは 18567でウィリアム ・ ヘンリー ・ パーキンが発見した、好酸性のメタクロマジー汚れをいくつかの医療応用8で使用されています。樹脂包埋神経セグメントから得られるトルイジン ブルー染色末梢神経節神経構造の明確な可視化が可能です。ミエリン鞘構造の可視化は、四酸化オスミウム ポスト固定4,9を使用して拡張できます。四酸化オスミウムは有毒酸化および脂質定着性エージェントの脂質の二重結合と対話する全く定義された脂質が豊富な髄鞘10の結果します。ただし、四酸化オスミウムは毒性、高価、長い神経セグメント, 培養を必要とし、常にされていません。
末梢神経形態の可視化のための処理と染色方法が開発されています。パラフィン、極低温断面とエポキシ樹脂埋め込み神経断面トルイジン ブルーで染色に続くまたはフェニレンジアミン ソリューションは、末梢神経再生11,12 の形態学的変化を定量化に使用されています.これらのメソッドは各軸索、ミエリン厚、軸索の直径、および有髄繊維径 (g 比) 11,13,14,15 軸索直径の数に自分の長所と収量の重要なデータがあります。.
このプロトコルでは樹脂埋め込む型の主な違いは、神経の組織学的品質を維持しながら樹脂の硬度による 1-2 μ m 厚の断面を得ることが容易です。埋め込み、パラフィンから 4-5 μ m 厚の切片ではなく、これらの薄いセクションを提供できない g 比などの軸索の髄鞘のより正確な定量化を可能にする、高解像度の末梢神経節厚いセクション16から得られます。極低温断面は 1-2 μ m のセクションを取得する使用できますが、多数の大規模な亀裂なしセクションを得ることは困難である私たちの経験をされています。このようなひびの入ったセクションは、髄鞘形成の側面と軸索の数の不正確なカウント可能性があります。
銀染色法18マッソンのヒアリン染色4は、トルイジン ブルー染色17、に加えて神経軸索を表示する使用できます。ただし、対し、トルイジン ブルー染色ミエリン鞘の明確なイメージを示し、簡単にすることができますヘマトキシリンとエオシンまたはマッソンのヒアリン示したかすかなミエリン鞘と認識できない構造ステンド グラス樹脂埋め込みラット正中神経断面を使用定量化された4になります。いくつかの制限にもかかわらずトルイジン ブルー染色樹脂の周辺神経、神経形態の高解像度の画像が必要な場合に使用できる貴重な手法です。
樹脂を埋め込むための主な欠点は、それは時間がかかり、パラフィンおよび凍結する埋め込まれたセクションの技術と比較されたときの抗原検索の難しさのため同じ組織の免疫染色を許可しません。したがって、トルイジン ブルー染色樹脂埋め込みを介して処理される免疫染色の同じ組織を活用することは一般的にはありません。免疫染色が必要な場合、ここで使用樹脂埋め込みのセクション、グリコール メタクリル酸樹脂を埋め込みの使用は、免疫染色組織切片上で実行するが、これは比較的高価な19。これは、固定後に直接別セグメント、樹脂を埋め込むためのいくつかおよび免疫染色の他に末梢神経を切断することによって多少軽減できます。
最も病理組織学的分析で、分けることができます 5 つの段階、固定、脱水を含む、埋め込み、断面、および20を染色、トルイジン ブルー染色樹脂のプロセスは末梢神経を埋め込まれています。トルイジン ブルーを取得する高品質の画像と埋め込みラット坐骨神経染色樹脂を使用してプロトコルおよび実用的な指針を提供するためにここを目指します。
Protocol
Representative Results
Discussion
末梢神経損傷と再生の形態学的構造の検査、頻繁に研究13の。このプロトコルでは樹脂製ブロックに埋め込まれ、トルイジン ブルーで染色のラット坐骨神経組織を用いた組織学的データ数量の高品質の画像を取得する手順をについて説明します。この手法は、神経再生を軸索の数、髄鞘形成、浸潤線維組織の存在や健康神経の程度を測定することによって示すことができる?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者は、彼らの助けと動物の世話の援助のケリー ロバロ、ヘイデンは True、Wupu Osimanjiang、スバーシュ Dhunghana ブッシュマン ラボのメンバーのためのワイオミングの大学のジェンキンス顕微鏡施設明見中学校みたいと思います。このパブリケーションによってできた制度開発賞 (アイデア) から国立科学研究所の一般医療補助金 # 2P20GM103432 [健康の国民の協会の。
Materials
| Dulbecco's Phosphate Buffer Saline | Gibco | 14200-075 | |
| Glutaraldehyde Solution | Sigma-Aldrich | G6257 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| Toluidine Blue O | Sigma-Aldrich | T3260 | |
| Sodium Tetraborate Decahydrate | Acros Organics | 205950010 | |
| Isoflurane | Piramal | NDC 66794-013-25 | |
| Epoxy Embedding Medium Kit | Sigma-Aldrich | 45359 | |
| Sodium Hydroxide Solution | Sigma-Aldrich | 72068 | To adjust Trump's fixative pH |
| Acetone | Fisher Chemical | 170942 | |
| Osmium Tetroxide Solution | Sigma-Aldrich | 75632 | |
| VWR Micro Slides, Superfrost Plus | VWR | 48311-703 | |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12545102 | |
| Pelco Embedding Cast | Fisher Scientific | NC9671811 | |
| Glass Knife Maker | RMC Products | GKM-2 | |
| Ultramicrotome | RMC Products | MT-XL | |
| 15 mL Conical Tube | Falcon | ISO 9001 | |
| Eppendorf 1.5 mL microcentrifuge tubes | Sigma-Aldrich | T9661 | |
| 4 mL Glass Vial | Sigma-Aldrich | 854190 | |
| Razor Blades | VWR | 55411-050 | For trimming resin block |
| Perfect Loop | Electron Microscopy Sciences | 70944 | For picking up thin resin sections |
| Ultra Glass Knife Strips 6.4 mm x 25 mm x 400 mm | Electron Microscopy Sciences | 71012 | |
| 100 Watt Oven | Millipore | 6350115 | |
| Whatman Filter Paper | Sigma-Aldrich | WHA10010155 | |
| 3 mL plastic pipette | Sigma-Aldrich | Z331740 | |
| Micro-surgical Kit | World precision instruments | ||
| Olympus fluorescence microscope | Dual CCD Color and Monochrome Camera, DP80 |
References
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