Toluidine bleu coloration des Sections enrobées dans la résine pour l’évaluation de la morphologie des nerfs périphériques
Summary
Nous présentons ici un protocole afin de visualiser les structures fines des nerfs périphériques en obtenant et en coloration de 1 à 2 µm sections avec toluidine bleu
Abstract
Nerfs périphériques s’étendent dans tout le corps, qui innervent les tissus cibles avec les axones moteurs ou sensoriels. En raison de la généralisation, les nerfs périphériques sont souvent endommagés en raison d’un traumatisme ou d’une maladie. Méthodes et stratégies ont été développées pour évaluer les lésions des nerfs périphériques dans des modèles animaux, fonction et régénération, analysant la morphométrie des nerfs périphériques est devenue une mesure essentielle issue terminale. Points de coloration du nerf croix bleu de toluidine obtenues des sections nerveuses résine intégrée est une méthode reproductible pour les évaluations qualitatives et quantitatives des nerfs périphériques, permettant la visualisation de morphologie nombre d’axones et le degré de myélinisation. Cette technique, comme pour beaucoup d’autres méthodes histologiques, peut être difficile à apprendre et à maîtriser à l’aide de protocoles standard de l’écrits. Cette publication vise donc à accentuer des protocoles écrits pour la coloration des nerfs périphériques à la vidéographie de la méthode, à l’aide de nerfs sciatiques récoltés des rats bleu de toluidine. Dans ce protocole, nous décrivons la fixation in vivo des nerfs périphériques et collection du tissu et après fixation avec 2 % le tétroxyde d’osmium, incorporant des nerfs dans la résine époxyde et ultramicrotome sectionnement des nerfs à 2μm-1 épaisseur. Les sections nerveuses puis transféré à une lame de verre et colorées au bleu de toluidine, après quoi ils sont quantitativement et qualitativement évalués. Exemples de problèmes les plus courants sont indiqués, ainsi que des mesures pour atténuer ces problèmes.
Introduction
Nerfs périphériques s’étendent dans tout le corps, qui innervent les tissus cibles avec des axones moteurs ou sensoriels1. Nerfs périphériques congénitales causées par des troubles médicaux et les traumatismes représentent un problème majeur de santé publique et ont de grandes incidences économiques2,3. Malgré les progrès dans l’évaluation des résultats des lésions des nerfs périphériques et comprendre la régénération nerveuse, les méthodes traditionnelles comme l’histologie nerveuse et des techniques de coloration sont des outils indispensables pour évaluer qualitativement et quantitativement la santé nerveuse comme une mesure de résultat terminal dans des modèles animaux ou des tissus humains excisés. Ceci est souvent associé à des mesures électrophysiologiques de la fonction de nerf périphérique, où la morphométrie peut révéler pourquoi la régénération nerveuse fonctionnelle n’a ou n’a pas eu lieu.
Le bleu de toluidine souillant des sections de nerfs périphériques semi mince résine intégrée est une méthode spécialisée pour l’imagerie des fibres nerveuses myélinisées, de haute qualité et effacer des images détaillées de nerf structures4,5,6 . Le bleu de toluidine est un colorant métachromatique acidophile, découvert par Perkin, en 1856,7et a été utilisé dans plusieurs applications médicales8. Sections de nerfs périphériques teinté bleu de toluidine provenant de segments de nerfs enrobées dans la résine permet une visualisation claire des structures nerveuses. Visualisation de la structure de la gaine de myéline peut être améliorée par l’utilisation de tétroxyde d’osmium après fixation4,9. Le tétroxyde d’osmium est un oxydant et lipides fixateur agent toxique qui interagit avec des doubles liaisons dans les lipides, résultant dans la gaine de myéline des riches en lipides nettement défini10. Toutefois, le tétroxyde d’osmium est toxique et cher, nécessite une période d’incubation plus longue des segments du nerf et n’est pas toujours utilisée.
Méthodes alternatives de traitement et de coloration ont été développés pour la visualisation de la morphologie du nerf périphérique ; Paraffine, sectionnement cryogéniques et sectionnement de nerfs enrobées dans la résine époxy suivie par coloration au bleu de toluidine ou phénylènediamine solution a été utilisée pour quantifier les changements morphologiques des nerfs périphériques régénération 11,12 . Ces méthodes ont leurs avantages et le rendement des données essentielles sur le nombre d’axones, l’épaisseur de la myéline, diamètre de l’axone et diamètre de l’axone à fibres myélinisées diamètre (g-ratio) 11,13,14,15 .
La principale distinction le plongement de résine dans le présent protocole est qu’il facilite l’obtention de 1 à 2 μm de sections transversales épaisseur en raison de la dureté de la résine tout en conservant les qualités histologiques du nerf. Ces coupes minces, plutôt que les sections d’épaisseur 4-5 μm provenant de paraffine déguisant, fournissent des sections de nerfs périphériques avec une résolution plus élevée, ce qui permet une quantification plus précise de la myélinisation des axones, tels que le g-rapport, qui ne peut pas être obtenu à partir de sections plus épais16. Sectionnement cryogéniques peut être utilisés pour obtenir des Articles de 1 à 2 µm, il a été notre expérience qu’il est plus difficile d’obtenir des sections sans grandes de nombreuses fissures. Ces sections fissurées peuvent causer comptage inexactes des aspects de la myélinisation et le nombre d’axones.
En plus de bleu de toluidine17, une médaille d’argent de coloration méthode18 et coloration trichrome de Masson4 permet également de montrer les axones. Toutefois, à l’aide de résine enrobage des sections de nerf médian rat teinté avec l’hématoxyline et éosine ou de Masson trichrome gaines de myéline ont montré faibles et structures non reconnus, alors que le bleu de toluidine coloration a montré clairement la myéline gaine image et peut facilement être quantifiés4. Malgré quelques limitations, nerfs de coloration de résine intégrée périphérique bleu de toluidine est une technique qui peut être utilisée lorsque des images de haute résolution de morphologie de nerf sont requises.
L’inconvénient principal pour l’incorporation de la résine est qu’il prend du temps et ne permet pas d’immunomarquage du même tissu en raison de la difficulté de recherche d’antigène par rapport à la paraffine et des techniques de coupes congelées d’incorporé. Ainsi, il n’est pas généralement possible d’utiliser le même tissu pour immunostaining qui est traitée par enrobage résine pour coloration bleu de toluidine. Bien que pas utilisé ici, si vous souhaitez l’immunohistochimie en résine sections embarquées, l’utilisation de l’incorporation des résines de méthacrylate de glycol permet l’immunohistochimie sur coupes de tissus, mais c’est relativement cher19. Cela peut être quelque peu atténué en coupant les nerfs périphériques en segments distincts, certains pour enrobage résine e.a. pour immunostaining directement après fixation.
Le processus de formation de bleu de toluidine taches de résine intégrée des nerfs périphériques, comme l’analyse histopathologique plus, peut être divisé en cinq étapes, y compris la fixation, déshydratation, enrobage, sectionnement et20de coloration. Notre objectif ici est de fournir un protocole et des lignes directrices pratiques pour l’utilisation de résine teintées de sections de nerf sciatique de rat embarqués avec des images de haute qualité toluidine bleu d’acquérir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Examens des structures morphologiques des lésions du nerf périphérique et la régénération sont fréquents sujets d’étude13. Dans ce protocole, nous décrivons les étapes pour obtenir des images de haute qualité pour les analyses quantitatives de données histologiques à l’aide de tissu de nerf sciatique du rat incorporés dans des blocs de résine et colorées au bleu de toluidine. Cette technique fournit une image de la morphologie de nerf dans laquelle la régénération nerveuse p…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs désirent thankthe Jenkins Microscopy Facility à l’Université du Wyoming pour leur aide et les membres du laboratoire Bushman, Kelly Roballo, Hayden vrai, Wupu Osimanjiang et Philippe Dhunghana, pour l’assistance au soin des animaux. Cette publication a été rendue possible par une sentence de développement institutionnel (IDeA) de la National Institute of General Medical Sciences, de la National Institutes of Health sous Grant # 2P20GM103432.
Materials
| Dulbecco's Phosphate Buffer Saline | Gibco | 14200-075 | |
| Glutaraldehyde Solution | Sigma-Aldrich | G6257 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| Toluidine Blue O | Sigma-Aldrich | T3260 | |
| Sodium Tetraborate Decahydrate | Acros Organics | 205950010 | |
| Isoflurane | Piramal | NDC 66794-013-25 | |
| Epoxy Embedding Medium Kit | Sigma-Aldrich | 45359 | |
| Sodium Hydroxide Solution | Sigma-Aldrich | 72068 | To adjust Trump's fixative pH |
| Acetone | Fisher Chemical | 170942 | |
| Osmium Tetroxide Solution | Sigma-Aldrich | 75632 | |
| VWR Micro Slides, Superfrost Plus | VWR | 48311-703 | |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12545102 | |
| Pelco Embedding Cast | Fisher Scientific | NC9671811 | |
| Glass Knife Maker | RMC Products | GKM-2 | |
| Ultramicrotome | RMC Products | MT-XL | |
| 15 mL Conical Tube | Falcon | ISO 9001 | |
| Eppendorf 1.5 mL microcentrifuge tubes | Sigma-Aldrich | T9661 | |
| 4 mL Glass Vial | Sigma-Aldrich | 854190 | |
| Razor Blades | VWR | 55411-050 | For trimming resin block |
| Perfect Loop | Electron Microscopy Sciences | 70944 | For picking up thin resin sections |
| Ultra Glass Knife Strips 6.4 mm x 25 mm x 400 mm | Electron Microscopy Sciences | 71012 | |
| 100 Watt Oven | Millipore | 6350115 | |
| Whatman Filter Paper | Sigma-Aldrich | WHA10010155 | |
| 3 mL plastic pipette | Sigma-Aldrich | Z331740 | |
| Micro-surgical Kit | World precision instruments | ||
| Olympus fluorescence microscope | Dual CCD Color and Monochrome Camera, DP80 |
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