परिधीय तंत्रिका आकृति विज्ञान के मूल्यांकन के लिए राल एम्बेडेड वर्गों के Toluidine नीले दाग
Summary
यहां हम प्राप्त करने और toluidine नीले रंग के साथ 1-2 µm वर्गों धुंधला द्वारा परिधीय नसों की ठीक संरचनाओं कल्पना करने के लिए एक प्रोटोकॉल मौजूद
Abstract
परिधीय नसों शरीर भर में फैली हुई, innervating लक्ष्य ऊतकों मोटर या संवेदी axons के साथ. व्यापक वितरण के कारण, परिधीय नसों अक्सर आघात या रोग के कारण क्षतिग्रस्त हो रहे हैं । के रूप में तरीकों और रणनीतियों के लिए पशु मॉडल, समारोह और पुनर्जनन में परिधीय तंत्रिका चोट का आकलन विकसित किया गया है, परिधीय तंत्रिका के morphometry का विश्लेषण एक आवश्यक टर्मिनल परिणाम माप बन गया है । Toluidine ब्लू तंत्रिका क्रॉस राल एम्बेडेड तंत्रिका वर्गों से प्राप्त वर्गों के दाग परिधीय नसों के गुणात्मक और मात्रात्मक आकलन के लिए एक reproducible विधि है, axons और की डिग्री की आकृति विज्ञान की संख्या के दृश्य को सक्षम करने myelination । इस तकनीक, कई अंय ऊतकवैज्ञानिक तरीकों के साथ के रूप में, जानने के लिए और मानक लिखा प्रोटोकॉल का उपयोग कर गुरु मुश्किल हो सकता है । इस प्रकाशन के इरादे इसलिए विधि की वीडियोग्राफी के साथ परिधीय नसों के toluidine नीले दाग के लिए लिखा प्रोटोकॉल दबाव का चिह्न है, sciatic नसों चूहों से काटा का उपयोग कर । इस प्रोटोकॉल में, हम vivo परिधीय तंत्रिका निर्धारण और ऊतक के संग्रह में वर्णन, और बाद निर्धारण 2% आज़मियम tetroxide के साथ, epoxy राल में नसों की embedding, और ultramicrotome 1-2 माइक्रोन मोटाई के लिए नसों के अनुभाग । तंत्रिका वर्गों तो एक गिलास स्लाइड को हस्तांतरित और toluidine नीले रंग के साथ दाग है, जिसके बाद वे मात्रात्मक और गुणात्मक मूल्यांकन कर रहे हैं । सबसे आम समस्याओं के उदाहरण, साथ ही इन समस्याओं को कम करने के लिए कदम दिखाए जाते हैं ।
Introduction
परिधीय नसों शरीर भर में फैली, innervating लक्ष्य ऊतकों मोटर या संवेदी axons1के साथ. परिधीय तंत्रिका चिकित्सा विकारों और आघात की वजह से दोष एक प्रमुख सार्वजनिक स्वास्थ्य चिंता का प्रतिनिधित्व करते है और बड़े आर्थिक प्रभावों2,3है । परिधीय तंत्रिका चोटों और समझ तंत्रिका पुनर्जनन के परिणामों का आकलन करने में अग्रिम के बावजूद, ऐसे तंत्रिका प्रोटोकॉल और धुंधला तकनीक के रूप में पारंपरिक तरीकों को गुणात्मक और मात्रात्मक तंत्रिका स्वास्थ्य का आकलन करने के लिए आवश्यक उपकरण है पशु मॉडल या उत्पादत्मक मानव ऊतक में एक टर्मिनल परिणाम माप के रूप में । यह अक्सर परिधीय तंत्रिका समारोह के electrophysiological माप के साथ बनती है, जहां morphometry प्रकट कर सकते है क्यों कार्यात्मक तंत्रिका पुनर्जनन किया था या नहीं हो ।
Toluidine नीले राल के धुंधला-अर्द्ध पतली परिधीय तंत्रिका वर्गों एम्बेडेड इमेजिंग myelinated तंत्रिका तंतुओं के लिए एक विशेष विधि है, उच्च गुणवत्ता प्रदान करता है और तंत्रिका संरचनाओं के स्पष्ट विस्तृत छवियों4,5,6 . Toluidine ब्लू एक acidophilic metachromatic दाग, १८५६7में विलियम हेनरी Perkin द्वारा की खोज की है, और कई चिकित्सा अनुप्रयोगों8में इस्तेमाल किया गया है । Toluidine नीले दाग परिधीय तंत्रिका वर्गों राल से प्राप्त-एंबेडेड तंत्रिका क्षेत्रों तंत्रिका संरचनाओं के स्पष्ट दृश्य के लिए अनुमति देता है । myelin म्यान संरचना के दृश्य आज़मियम tetroxide पद निर्धारण4,9के उपयोग से बढ़ाया जा सकता है । आज़मियम tetroxide एक विषैले ऑक्सीडेंट और लिपिड निर्धारण एजेंट है जो लिपिड में दोहरे बांड के साथ इंटरैक्ट करता है, जिसके परिणामस्वरूप लिपिड-रिच myelin म्यान10होते हैं । हालांकि, आज़मियम tetroxide विषाक्त, महंगा है, तंत्रिका क्षेत्रों की एक लंबी गर्मी की आवश्यकता है, और हमेशा इस्तेमाल नहीं किया है ।
प्रसंस्करण और धुंधला के वैकल्पिक तरीकों परिधीय तंत्रिका आकृति विज्ञान के दृश्य के लिए विकसित किया गया है; आयल, क्रायोजेनिक खोदी, और epoxy राल एंबेडेड तंत्रिका toluidine नीले या phenylenediamine समाधान के साथ दाग के बाद खोदी है परिधीय तंत्रिका पुनर्जनन 11,12 के रूपात्मक परिवर्तन यों तो इस्तेमाल किया गया है . इन तरीकों से प्रत्येक अपने फायदे और उपज axons, myelin मोटाई, axon व्यास, और axon व्यास की संख्या पर आवश्यक डेटा myelinated फाइबर व्यास (जी अनुपात) 11,13,14,15 .
राल के प्राथमिक अंतर-इस प्रोटोकॉल में एंबेडिंग है कि यह 1-2 माइक्रोन मोटाई पार-राल की कठोरता के कारण वर्गों को प्राप्त करने, जबकि तंत्रिका के ऊतकवैज्ञानिक गुणों को बनाए रखने की सुविधा है । इन पतले वर्गों, के रूप में 4-5 माइक्रोन मोटाई तेल embedding से प्राप्त वर्गों का विरोध किया, उच्च संकल्प के साथ परिधीय तंत्रिका वर्गों प्रदान करते हैं, axon myelination के एक और अधिक सटीक ठहराव के लिए अनुमति देता है, जैसे जी अनुपात, कि नहीं किया जा सकता मोटा वर्गों16से प्राप्त की । जबकि क्रायोजेनिक खोदी 1-2 µm वर्गों को प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, यह हमारे अनुभव रहा है कि यह कई बड़ी दरारों के बिना वर्गों को प्राप्त करने के लिए और अधिक कठिन है । इस तरह के टूट वर्गों axons और myelination के पहलुओं की संख्या की गलत गिनती पैदा कर सकता है ।
toluidine नीले दाग17के अलावा, एक चांदी धुंधला विधि18 और Masson के trichrome धुंधला4 भी तंत्रिका axons दिखाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । हालांकि, का उपयोग राल चूहे की एंबेडिंग माध्य तंत्रिका या तो hematoxylin और eosin या Masson trichrome के साथ सना हुआ वर्गों बेहोश myelin खोल और अपरिचित संरचनाओं दिखाया, जबकि toluidine नीले दाग स्पष्ट myelin म्यान छवि दिखाया और आसानी से कर सकते है हो quantified4. कुछ सीमाओं के बावजूद, toluidine ब्लू राल एम्बेडेड परिधीय नसों के दाग एक मूल्यवान तकनीक है कि जब तंत्रिका आकृति विज्ञान की उच्च संकल्प छवियों की आवश्यकता है इस्तेमाल किया जा सकता है ।
राल embedding के लिए प्राथमिक नुकसान यह है कि यह समय लेने वाली है और immunostaining के लिए अनुमति नहीं antigen पुनर्प्राप्ति की कठिनाई के कारण एक ही ऊतक के लिए जब तेल और जमे हुए एंबेडेड वर्गों तकनीकों की तुलना में । इस प्रकार, यह आम तौर पर immunostaining कि राल के माध्यम से संसाधित है के लिए एक ही ऊतक का उपयोग संभव नहीं है-toluidine नीले दाग के लिए embedding । हालांकि यहां इस्तेमाल नहीं किया, अगर immunohistochemistry राल एंबेडेड वर्गों में वांछित है, ग्लाइकोल methacrylate embedding रेजिन के उपयोग के लिए immunohistochemistry ऊतक वर्गों पर प्रदर्शन किया जा करने के लिए अनुमति देता है, लेकिन यह अपेक्षाकृत महंगा है19। यह कुछ अलग क्षेत्रों में परिधीय तंत्रिका काटने से कम हो सकता है, कुछ राल के लिए-embedding और immunostaining के लिए दूसरों को सीधे निर्धारण के बाद ।
toluidine की प्रक्रिया नीले राल एंबेडेड परिधीय नसों के दाग, के रूप में सबसे histopathological विश्लेषण के साथ, पांच चरणों में भंग किया जा सकता है, निर्धारण सहित, निर्जलीकरण, embedding, अनुभाग, और दाग20। हम यहां उद्देश्य के लिए एक प्रोटोकॉल और राल एंबेडेड चूहे sciatic तंत्रिका toluidine नीले रंग के साथ दाग उच्च गुणवत्ता छवियां प्राप्त वर्गों का उपयोग करने के लिए व्यावहारिक दिशानिर्देश प्रदान करते हैं ।
Protocol
Representative Results
Discussion
परिधीय तंत्रिका चोट और पुनर्जनन के रूपात्मक संरचनाओं की परीक्षा13अध्ययन के लगातार विषयों रहे हैं । इस प्रोटोकॉल में, हम कदम का वर्णन करने के लिए उच्च गुणवत्ता छवियां प्राप्त करने के लिए ऊतकवै?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों को उनकी मदद के लिए Wyoming विश्वविद्यालय में Jenkins माइक्रोस्कोपी सुविधा thankthe करना चाहते हैं, और पशु देखभाल में सहायता के लिए बुशमैन लैब, केली Roballo, हेडन सच, Wupu Osimanjiang और सुबाष Dhunghana, के सदस्यों को । यह प्रकाशन एक संस्थागत विकास पुरस्कार (आइडिया) द्वारा राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ जनरल मेडिकल साइंसेज से ग्रांट # 2P20GM103432 के तहत संभव बनाया गया था ।
Materials
| Dulbecco's Phosphate Buffer Saline | Gibco | 14200-075 | |
| Glutaraldehyde Solution | Sigma-Aldrich | G6257 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| Toluidine Blue O | Sigma-Aldrich | T3260 | |
| Sodium Tetraborate Decahydrate | Acros Organics | 205950010 | |
| Isoflurane | Piramal | NDC 66794-013-25 | |
| Epoxy Embedding Medium Kit | Sigma-Aldrich | 45359 | |
| Sodium Hydroxide Solution | Sigma-Aldrich | 72068 | To adjust Trump's fixative pH |
| Acetone | Fisher Chemical | 170942 | |
| Osmium Tetroxide Solution | Sigma-Aldrich | 75632 | |
| VWR Micro Slides, Superfrost Plus | VWR | 48311-703 | |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12545102 | |
| Pelco Embedding Cast | Fisher Scientific | NC9671811 | |
| Glass Knife Maker | RMC Products | GKM-2 | |
| Ultramicrotome | RMC Products | MT-XL | |
| 15 mL Conical Tube | Falcon | ISO 9001 | |
| Eppendorf 1.5 mL microcentrifuge tubes | Sigma-Aldrich | T9661 | |
| 4 mL Glass Vial | Sigma-Aldrich | 854190 | |
| Razor Blades | VWR | 55411-050 | For trimming resin block |
| Perfect Loop | Electron Microscopy Sciences | 70944 | For picking up thin resin sections |
| Ultra Glass Knife Strips 6.4 mm x 25 mm x 400 mm | Electron Microscopy Sciences | 71012 | |
| 100 Watt Oven | Millipore | 6350115 | |
| Whatman Filter Paper | Sigma-Aldrich | WHA10010155 | |
| 3 mL plastic pipette | Sigma-Aldrich | Z331740 | |
| Micro-surgical Kit | World precision instruments | ||
| Olympus fluorescence microscope | Dual CCD Color and Monochrome Camera, DP80 |
References
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