SiRNA نانوحبيبات بوساطة إسكات الجينات في قلب الزرد الكبار
Summary
فإنه يظل تحديا كبيرا لوضع الشرطي الجينات-خروج المغلوب أو فعالية الجينات-ضربة قاضية في الأجهزة الزرد الكبار. هنا نحن تقرير وضع بروتوكول للمنفذ siRNA نانوحبيبات بوساطة إسكات الجينات في قلب الزرد الكبار، مما يوفر طريقة فقدان لوظيفة جديدة لدراسة الأجهزة الكبار في الزرد والكائنات الأخرى في النموذج.
Abstract
الثدييات لديها قدرة محدودة للغاية لتجديد القلب بعد احتشاء عضلة القلب. من ناحية أخرى، تجدد الزرد الكبار قلبها بعد بتر ابيكس أو كريوينجوري، مما يجعل من الكائن حي نموذجا هاما لدراسة تجديد القلب. ومع ذلك، قيدت عدم وجود أساليب فقدان لوظيفة لأجهزة الكبار ثاقبة الآليات الأساسية لإنعاش القلب. تدخل الجيش الملكي النيبالي عبر مختلف نظم إيصالها أداة قوية لإسكات الجينات في خلايا الثدييات والكائنات نموذج. وقد أبلغنا سابقا أن جسيمات نانوية siRNA مغلفة بنجاح إدخال الخلايا وينتج ضربة قاضية خاصة بالجينات ملحوظا في قلب الكبار الزرد تجديد. نقدم هنا، بروتوكول بسيطة وسريعة وفعالة لإيصال ديندريمير بوساطة siRNA وإسكات الجينات في قلب الكبار الزرد تجديد. هذا الأسلوب يوفر نهج بديل لتحديد وظائف الجينات في الأجهزة الكبار في الزرد، ويمكن تمديدها إلى نموذج الكائنات الحية الأخرى، وكذلك.
Introduction
احتشاء عضلة القلب قد أصبح يشكل تهديدا رئيسيا لصحة، المؤدية إلى عبئا اقتصاديا هائلا حول العالم1. فشل قلب الثدييات الكبار لإنعاش وتجديد cardiomyocytes المفقودة على نطاق عيانية بعد الإصابة، مما يؤدي إلى تشكيل ندبة الأنسجة وقصور القلب اللاحقة. خلافا للثدييات، الزرد قادرة على إنعاش القلب، أساسا من خلال انتشار احتشاء عضلة القلب قوية بعد أنواع مختلفة من إصابات القلب، جعله كائن نموذج مثالي للتحقيق في الآليات الجزيئية لإنعاش القلب 2،3،4،،من56،،من78. فك رموز الآليات الذاتية الكامنة وراء تجديد القلب الزرد مجالاً مثيرة للبحث في البحث عن رواية الاستراتيجيات العلاجية لتحسين قلب الإنسان التجديد9.
تتوفر أساليب التلاعب بالجينات في الزرد. وتتألف هذه من مورفولينوس (MO) التي تستخدم أيضا على نطاق واسع في الفرخ، الضفادع والثدييات إلى جانب في الزرد10،11،،من1213. وقد مو كفاءة ضربة قاضية للتعبير الجيني المستهدف في فنلندا الزرد الكبار والمخ، وشبكية العين14،،من1516،17،،من1819. الأحماض النووية مؤمنة (LNA) هو آخر اليغنوكليوتيد الاصطناعية المستخدمة نهدم التعبير الجيني الذاتية ليس فقط في الأجنة الزرد ولكن أيضا في أجهزة الحيوان البالغين20،،من2122، 23 , 24-ومع ذلك، لا يزال انعدام أساليب فقدان لوظيفة فعالة لقلوب الكبار عقبة في دراسة الآليات الجزيئية لتجديد الجهاز. في مثبطات الحاضر، جزيء صغير أو التعبير المحورة وراثيا من طفرات السلبية المهيمنة تستخدم أساسا لمنع وظيفة الجينات معينة أو مسار لدراسة وظيفتها في الزرد الكبار قلب التجديد25،26 ،27. ومع ذلك، ليس كل الجينات أو مسارات إشارات قابلة للتطبيق لهذه الأساليب.
الكشف التدخل الصغيرة (سيرناس) تستخدم على نطاق واسع لتحليل الخسارة من الدالة في خلايا الثدييات والأجنة من طراز الكائنات الحية، فضلا عن أجهزة الكبار لنماذج الدراسات الإكلينيكية في الحيوان28،،من2930 , 31 , 32-سيرناس قد استخدمت فعلياً لإسكات الجينات في أورام33،،من3435 وفي cardiomyocytes36،،من3738،39 ،40 عبر مختلف نظم إيصالها. في الآونة الأخيرة، قمنا بتطوير كفاءة نانوحبيبات مغلفة siRNA إسكات الجينات في قلب الكبار تجديد استخدام عدة جسيمات نانوية مختلفة41،،من4243، توفير أداة جديدة الدراسات الفنية للجينات في الأجهزة الزرد الكبار. تستند جهودنا السابقة الدراسات42،،من4143، هنا نقدم بروتوكول بسيطة، وعملية، ولكن قوية لإسكات الجينات في قلب الكبار الزرد تجديد استخدام f-بامام-شماعة-R9 siRNA ديندريميرس. Aldh1a2 (ألدهيد نازعة 1، أفراد الأسرة A2) الجينات upregulated بعد الزرد ابيكس الاستئصال والاجتثاث من Aldh1a2 حظر تجديد القلب44. ونحن هنا نلقي جين aldh1a2 كمثال لاختبار كفاءة ضربة قاضية الجيني بحقن siRNA مغلفة نانوحبيبات وساطة. يتضمن هذا البروتوكول إجراء لاستئصال القلب الزرد والتوليف الكيميائي لجسيمات نانوية وأسلوب تسليم على جسيمات نانوية siRNA مغلفة في قلب الزرد الكبار.
Protocol
Representative Results
Discussion
الزرد قادر تماما على تجديد مجموعة متنوعة من الأجهزة بما في ذلك في قلب الكبار5. بينما المعدلة وراثيا والوراثية أساليب متطورة لدراسة وظائف الجينات في أجنة الزرد، تزال تواجه المحققين مع المهمة الشاقة المتمثلة في توليد الآليلات متحولة الشرطي في الزرد45،<sup class="x…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يشكر المؤلفون الدكتور جيم روس للتعليقات الانتقادية وقراءة المخطوطة. وأيد هذا العمل منح من الوطنية الطبيعية مؤسسة العلوم الصينية (31430059، 31701272، 31730061، 81470399، و 31521062)، وآسيا استرا زينيكا، والطب المبتكرة الأسواق الناشئة والتنمية في وقت مبكر.
Materials
| tricaine | Sigma | E10521 | Store at 4°C |
| stereomicroscope | Leica | S8AP0 | |
| sharp forcep | WPI | 14098 | |
| iridectomy scissors | WPI | 501778 | |
| elbow tweezers | Suzhou Liuliu | SE05Cr | |
| α,ω-dipyridyl disulfido polyethylene glycol(Py-PEG-Py) | Biomatrik (Jiaxing) Inc. | 5239 | |
| core of G4.0 polyamidoamine (PAMAM) | Andrews ChemServices | AuCS-297 | |
| vacuum drying equipment | Yiheng | DZF-6020 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Gibco | 14190144 | |
| tris(2-carboxyethyl)phosphine(TCEP) | Alfar Aesar | 51805-45-9 | Causes severe skin burns and eye damage. Causes serious eye damage. |
| ultrafiltration tube | Millipore | UFC900308 | |
| freeze dryer | Martin Christ | Alpha 2-4 Ldplus | |
| NMR spectrometer | Bruker | AV400 | |
| Deuterium oxide(D2O) | J&K | 174611 | |
| NMR sample tube | J&K | WG-1000-7-50 | |
| 3 kDa MWCO ultrafiltration tube | Merck | UFC900308 | |
| sea salts | Instant Ocean® | SS15-10 |
References
- Writing Group Members. Executive Summary: Heart Disease and Stroke Statistics–2016 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 133 (4), 447-454 (2016).
- Chablais, F., Veit, J., Rainer, G., Jazwinska, A. The zebrafish heart regenerates after cryoinjury-induced myocardial infarction. BMC Dev Biol. 11, 21 (2011).
- Gonzalez-Rosa, J. M., Martin, V., Peralta, M., Torres, M., Mercader, N. Extensive scar formation and regression during heart regeneration after cryoinjury in zebrafish. Development. 138 (9), 1663-1674 (2011).
- Parente, V., et al. Hypoxia/reoxygenation cardiac injury and regeneration in zebrafish adult heart. PLoS One. 8 (1), 53748 (2013).
- Poss, K. D., Wilson, L. G., Keating, M. T. Heart regeneration in zebrafish. Science. 298 (5601), 2188-2190 (2002).
- Raya, A., et al. Activation of Notch signaling pathway precedes heart regeneration in zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 11889-11895 (2003).
- Schnabel, K., Wu, C. C., Kurth, T., Weidinger, G. Regeneration of cryoinjury induced necrotic heart lesions in zebrafish is associated with epicardial activation and cardiomyocyte proliferation. PLoS One. 6 (4), 18503 (2011).
- Wang, J., et al. The regenerative capacity of zebrafish reverses cardiac failure caused by genetic cardiomyocyte depletion. Development. 138 (16), 3421-3430 (2011).
- Gonzalez-Rosa, J. M., Burns, C. E., Burns, C. G. Zebrafish heart regeneration: 15 years of discoveries. Regeneration (Oxf). 4 (3), 105-123 (2017).
- Heasman, J., Kofron, M., Wylie, C. Beta-catenin signaling activity dissected in the early Xenopus embryo: a novel antisense approach. Dev Biol. 222 (1), 124-134 (2000).
- Nasevicius, A., Ekker, S. C. Effective targeted gene ‘knockdown’ in zebrafish. Nat Genet. 26 (2), 216-220 (2000).
- Coonrod, S. A., Bolling, L. C., Wright, P. W., Visconti, P. E., Herr, J. C. A morpholino phenocopy of the mouse mos mutation. Genesis. 30 (3), 198-200 (2001).
- London, C. A., et al. A novel antisense inhibitor of MMP-9 attenuates angiogenesis, human prostate cancer cell invasion and tumorigenicity. Cancer Gene Ther. 10 (11), 823-832 (2003).
- Kizil, C., Otto, G. W., Geisler, R., Nusslein-Volhard, C., Antos, C. L. Simplet controls cell proliferation and gene transcription during zebrafish caudal fin regeneration. Dev Biol. 325 (2), 329-340 (2009).
- Thummel, R., et al. Inhibition of zebrafish fin regeneration using in vivo. electroporation of morpholinos against fgfr1 and msxb. Dev Dyn. 235 (2), 336-346 (2006).
- Kizil, C., Brand, M. Cerebroventricular microinjection (CVMI) into adult zebrafish brain is an efficient misexpression method for forebrain ventricular cells. PLoS One. 6 (11), 27395 (2011).
- Kizil, C., Iltzsche, A., Kaslin, J., Brand, M. Micromanipulation of gene expression in the adult zebrafish brain using cerebroventricular microinjection of morpholino oligonucleotides. J Vis Exp. (75), e50415 (2013).
- Craig, S. E., et al. The zebrafish galectin Drgal1-l2 is expressed by proliferating Muller glia and photoreceptor progenitors and regulates the regeneration of rod photoreceptors. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (6), 3244-3252 (2010).
- Thummel, R., Bailey, T. J., Hyde, D. R. In vivo electroporation of morpholinos into the adult zebrafish retina. J Vis Exp. (58), e3603 (2011).
- Rayburn, E. R., Zhang, R. Antisense, RNAi and gene silencing strategies for therapy: mission possible or impossible. Drug Discov Today. 13 (11-12), 513-521 (2008).
- Seth, P. P., et al. Short antisense oligonucleotides with novel 2′-4′ conformationaly restricted nucleoside analogues show improved potency without increased toxicity in animals. J Med Chem. 52 (1), 10-13 (2009).
- Prakash, T. P., et al. Antisense oligonucleotides containing conformationally constrained 2′,4′-(N-methoxy)aminomethylene and 2′,4′-aminooxymethylene and 2′-O,4′-C-aminomethylene bridged nucleoside analogues show improved potency in animal models. J Med Chem. 53 (4), 1636-1650 (2010).
- Yamamoto, T., Nakatani, M., Narukawa, K., Obika, S. Antisense drug discovery and development. Future Med Chem. 3 (3), 339-365 (2011).
- Itoh, M., Nakaura, M., Imanishi, T., Obika, S. Target gene knockdown by 2′,4′-BNA/LNA antisense oligonucleotides in zebrafish. Nucleic Acid Ther. 24 (3), 186-191 (2014).
- Han, P., et al. Hydrogen peroxide primes heart regeneration with a derepression mechanism. Cell Res. 24 (9), 1091-1107 (2014).
- Jopling, C., et al. Zebrafish heart regeneration occurs by cardiomyocyte dedifferentiation and proliferation. Nature. 464 (7288), 606-609 (2010).
- Lepilina, A., et al. A dynamic epicardial injury response supports progenitor cell activity during zebrafish heart regeneration. Cell. 127 (3), 607-619 (2006).
- McManus, M. T., Sharp, P. A. Gene silencing in mammals by small interfering RNAs. Nat Rev Genet. 3 (10), 737-747 (2002).
- de Fougerolles, A., Vornlocher, H. P., Maraganore, J., Lieberman, J. Interfering with disease: a progress report on siRNA-based therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 6 (6), 443-453 (2007).
- Kim, D. H., Rossi, J. J. Strategies for silencing human disease using RNA interference. Nat Rev Genet. 8 (3), 173-184 (2007).
- McCaffrey, A. P., et al. Inhibition of hepatitis B virus in mice by RNA interference. Nat Biotechnol. 21 (6), 639-644 (2003).
- Raoul, C., et al. Lentiviral-mediated silencing of SOD1 through RNA interference retards disease onset and progression in a mouse model of ALS. Nat Med. 11 (4), 423-428 (2005).
- Hu-Lieskovan, S., Heidel, J. D., Bartlett, D. W., Davis, M. E., Triche, T. J. Sequence-specific knockdown of EWS-FLI1 by targeted, nonviral delivery of small interfering RNA inhibits tumor growth in a murine model of metastatic Ewing’s sarcoma. Cancer Res. 65 (19), 8984-8992 (2005).
- Schiffelers, R. M., et al. Cancer siRNA therapy by tumor selective delivery with ligand-targeted sterically stabilized nanoparticle. Nucleic Acids Res. 32 (19), 149 (2004).
- Yang, X. Z., et al. Systemic delivery of siRNA with cationic lipid assisted PEG-PLA nanoparticles for cancer therapy. J Control Release. 156 (2), 203-211 (2011).
- Ko, Y. T., Hartner, W. C., Kale, A., Torchilin, V. P. Gene delivery into ischemic myocardium by double-targeted lipoplexes with anti-myosin antibody and TAT peptide. Gene Ther. 16 (1), 52-59 (2009).
- Liu, J., et al. Functionalized dendrimer-based delivery of angiotensin type 1 receptor siRNA for preserving cardiac function following infarction. Biomaterials. 34 (14), 3729-3736 (2013).
- Nam, H. Y., Kim, J., Kim, S. W., Bull, D. A. Cell targeting peptide conjugation to siRNA polyplexes for effective gene silencing in cardiomyocytes. Mol Pharm. 9 (5), 1302-1309 (2012).
- Nam, H. Y., McGinn, A., Kim, P. H., Kim, S. W., Bull, D. A. Primary cardiomyocyte-targeted bioreducible polymer for efficient gene delivery to the myocardium. Biomaterials. 31 (31), 8081-8087 (2010).
- Won, Y. W., McGinn, A. N., Lee, M., Bull, D. A., Kim, S. W. Targeted gene delivery to ischemic myocardium by homing peptide-guided polymeric carrier. Mol Pharm. 10 (1), 378-385 (2013).
- Diao, J., et al. PEG-PLA nanoparticles facilitate siRNA knockdown in adult zebrafish heart. Dev Biol. 406 (2), 196-202 (2015).
- Xiao, C., et al. Chromatin-remodelling factor Brg1 regulates myocardial proliferation and regeneration in zebrafish. Nat Commun. 7, 13787 (2016).
- Wang, F., et al. A Neutralized Noncharged Polyethylenimine-Based System for Efficient Delivery of siRNA into Heart without Toxicity. ACS Appl Mater Interfaces. 8 (49), 33529-33538 (2016).
- Kikuchi, K., et al. Retinoic acid production by endocardium and epicardium is an injury response essential for zebrafish heart regeneration. Dev Cell. 20 (3), 397-404 (2011).
- Hoshijima, K., Jurynec, M. J., Grunwald, D. J. Precise Editing of the Zebrafish Genome Made Simple and Efficient. Dev Cell. 36 (6), 654-667 (2016).
- Zu, Y., et al. TALEN-mediated precise genome modification by homologous recombination in zebrafish. Nat Methods. 10 (4), 329-331 (2013).
- Kesharwani, P., Gajbhiye, V., Jain, N. K. A review of nanocarriers for the delivery of small interfering RNA. Biomaterials. 33 (29), 7138-7150 (2012).
- Luong, D., et al. PEGylated PAMAM dendrimers: Enhancing efficacy and mitigating toxicity for effective anticancer drug and gene delivery. Acta Biomater. 43, 14-29 (2016).
- Luo, K., He, B., Wu, Y., Shen, Y., Gu, Z. Functional and biodegradable dendritic macromolecules with controlled architectures as nontoxic and efficient nanoscale gene vectors. Biotechnol Adv. 32 (4), 818-830 (2014).
- Shcharbin, D., Shakhbazau, A., Bryszewska, M. Poly(amidoamine) dendrimer complexes as a platform for gene delivery. Expert Opin Drug Deliv. 10 (12), 1687-1698 (2013).
