זה נשאר אתגר גדול לפתח מותנה נוקאאוט גנטי או יעיל ג’ין-נוקאאוט באיברים דג זברה למבוגרים. כאן אנחנו מדווחים על פרוטוקול עבור ביצוע siRNA בתיווך nanoparticle ג’ין להחרשת בלב דג זברה למבוגרים, ובכך מספק שיטה אובדן-של-פונקציה חדשה ללמוד. האיברים הבוגרים דג זברה ואורגניזמים אחרים מודל.
יונקים יש קיבולת מוגבלת מאוד לחדש את הלב לאחר אוטם שריר הלב. מצד שני, דג זברה בוגרת מחדש את הלב שלה לאחר כריתה איפקס או cryoinjury, שהופך אותו אורגניזם מודל חשוב עבור מחקר רגנרציה של הלב. עם זאת, העדר שיטות אובדן-של-תפקוד האיברים הבוגרים הגביל תובנות לגבי המנגנונים הלב התחדשות. התערבות ב RNA באמצעות מערכות אספקה שונים הוא כלי רב עוצמה עבור להשתיק גנים בתרבית של תאים ואורגניזמים מודל. אנחנו דיווחו בעבר כי חלקיקים אנקפסולציה siRNA בהצלחה הזן תאים וגוררים נוקאאוט גנטי ספציפי יוצאת דופן בלב דג זברה בוגרת ההתחדשות. כאן, אנו מציגים את פרוטוקול פשוט, מהיר ויעיל עבור משלוח siRNA בתיווך דנדרימר ו ג’ין להחרשת בלב דג זברה בוגרת ההתחדשות. שיטה זו מספקת גישה חלופית לקביעת ג’ין פונקציות באיברים למבוגרים בדג זברה, ניתן להרחיב אורגניזמים מודל אחרים גם כן.
אוטם שריר הלב, הפכה איום בריאותי גדול, שמוביל נטל כלכלי עצום ברחבי העולם1. הלב יונקים בוגרים נכשלת לחדש, לחדש את cardiomyocytes לאיבוד בקנה מידה מאקרוסקופית אחרי הפציעה, שמוביל היווצרות של רקמות צלקת ואי ספיקת לב עוקבות. בניגוד יונקים, דג זברה הוא מסוגל הלב התחדשות, בעיקר באמצעות התפשטות שריר הלב חזקים לאחר סוגים שונים של פגיעה בלב, שהופך אותו אורגניזם מודל אידיאלי בשביל לחקור את המנגנונים המולקולריים של התחדשות לב 2,3,4,5,6,7,8. התחדשות הבסיסית של הלב דג זברה בפענוח מנגנוני אנדוגני הוא אזור מרגש של מחקר בחיפוש אחר הרומן אסטרטגיות טיפוליות לשפר את לב האדם התחדשות9.
מניפולציה גנטית שיטות זמינות דג זברה. אלה מורכב morpholinos (מו) אשר נמצאים בשימוש נרחב גם צפרדעים, צ’יק, יונקים חוץ דג זברה10,11,12,13. מו יש נוקאאוט יעיל היעד גנים סנפיר דג זברה למבוגרים, המוח ולאחר רשתית14,15,16,17,18,19. נעול-nucleic חומצה (מגבר קדם) היא עוד oligonucleotide מלאכותי המשמש כדי להפיל את ביטוי גנים אנדוגני לא רק בדג זברה עוברי, אלא גם למבוגרים אברי חית20,21,22, 23 , 24. אולם חוסר של שיטות יעילות אובדן-של-פונקציה עבור לבבות המבוגרים נותרה מכשול בפני הלומדים את המנגנונים המולקולריים של התחדשות איברים. מעכבי הנוכחי, מולקולה קטנה או ביטוי הטרנסגניים של מוטציות דומיננטה-שלילי משמשים בעיקר כדי לחסום את הפונקציה של גנים מסוימים או מסלול ללמוד את תפקידה דג זברה בוגרת הלב התחדשות25,26 ,27. עם זאת, לא כל הגנים או איתות המסלולים הינם ישימים עבור שיטות אלה.
RNAs הפרעה קטנה (siRNAs) נמצאים בשימוש נרחב עבור ניתוח אובדן-של-פונקציה בתרבית של תאים, העוברים של מודל אורגניזמים, כמו גם איברים למבוגרים עבור מחקרים פרה חיה מודלים28,29,30 , 31 , 32. siRNAs שימשו באופן יעיל להשתקת גנים גידולים33,34,35 , cardiomyocytes36,37,38,39 ,40 באמצעות מערכות אספקה שונים. לאחרונה פיתחנו nanoparticle אנקפסולציה siRNA יעיל ג’ין-להחרשת בלב למבוגרים ההתחדשות באמצעות מספר חלקיקים שונים41,42,43, מתן כלי הרומן מחקרים פונקציונלי של גנים באיברים דג זברה למבוגרים. על סמך שלנו הקודם מחקרים41,42,43, כאן אנו מציגים עבור siRNA ג’ין להחרשת בלב דג זברה בוגרת ההתחדשות f-PAMAM-פג-R9 משתמש פרוטוקול פשוטה, פרקטית, עדיין חזק dendrimers. Aldh1a2 (אלדהיד דהידרוגנאז 1, בן משפחה A2) ג’ין היה upregulated לאחר כריתה איפקס דג זברה, אבלציה של Aldh1a2 חסם את התחדשות לב44. פה אנחנו לוקחים את aldh1a2 ג’ין לדוגמה כדי לבדוק את יעילות תמונות ציפורים גנים מתווכת על-ידי הזרקת אנקפסולציה nanoparticle siRNA. פרוטוקול זה מכיל הליך כריתה הלב דג זברה, סינתזה של חלקיקים של שיטת משלוח על חלקיקים אנקפסולציה siRNA ללב דג זברה למבוגרים.
דג זברה הוא לגמרי מסוגל של רגנרציה מגוון איברים כולל את הלב למבוגרים5. בעוד שיטות מהונדס גנטית הם מפותח ללמוד פונקציות גנים העוברים של דג זברה, החוקרים עדיין עומדות בפנינו משימה מרתיעה של יצירת אללים mutant מותנה בדג זברה45,46. לפיכך, מוטציות דומיננט…
The authors have nothing to disclose.
המחברים תודה ד ר ברוס IC תגובות ביקורתיות, לקרוא את כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מן הלאומי מדעי הטבע קרן של סין (31430059, 31701272, 31730061, 81470399 ו 31521062), חברת AstraZeneca אסיה, ולא מתעוררים תרופה חדשנית שוק התפתחות מוקדמת.
tricaine | Sigma | E10521 | Store at 4°C |
stereomicroscope | Leica | S8AP0 | |
sharp forcep | WPI | 14098 | |
iridectomy scissors | WPI | 501778 | |
elbow tweezers | Suzhou Liuliu | SE05Cr | |
α,ω-dipyridyl disulfido polyethylene glycol(Py-PEG-Py) | Biomatrik (Jiaxing) Inc. | 5239 | |
core of G4.0 polyamidoamine (PAMAM) | Andrews ChemServices | AuCS-297 | |
vacuum drying equipment | Yiheng | DZF-6020 | |
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Gibco | 14190144 | |
tris(2-carboxyethyl)phosphine(TCEP) | Alfar Aesar | 51805-45-9 | Causes severe skin burns and eye damage. Causes serious eye damage. |
ultrafiltration tube | Millipore | UFC900308 | |
freeze dryer | Martin Christ | Alpha 2-4 Ldplus | |
NMR spectrometer | Bruker | AV400 | |
Deuterium oxide(D2O) | J&K | 174611 | |
NMR sample tube | J&K | WG-1000-7-50 | |
3 kDa MWCO ultrafiltration tube | Merck | UFC900308 | |
sea salts | Instant Ocean® | SS15-10 |