SiRNA Nanoparticle-mediada-silenciamento no coração de Zebrafish adulto
Summary
Continua a ser um grande desafio para desenvolver condicional gene nocaute ou eficaz knockdown do gene-em órgãos adultos do zebrafish. Aqui nós relatamos um protocolo para desempenho siRNA nanoparticle-mediada silenciamento no coração de adultos do zebrafish, proporcionando assim um novo método de perda-de-função para estudar órgãos adultos no zebrafish e outros organismos-modelo.
Abstract
Mamíferos têm uma capacidade muito limitada para regenerar o coração após infarto do miocárdio. Por outro lado, o zebrafish adulto regenera seu coração após a ressecção do ápice ou cryoinjury, tornando-se um organismo importante modelo para estudo de regeneração do coração. No entanto, a falta de métodos de perda-de-função para órgãos adultos restrito insights sobre os mecanismos subjacentes a regeneração do coração. Interferência do RNA através de diferentes sistemas de entrega é uma ferramenta poderosa para o silenciamento de genes em células de mamíferos e organismos modelo. Informamos anteriormente que nanopartículas de siRNA-encapsulado com êxito inserir células e resultam em uma notável derrubada de gene-específico no coração adulto zebrafish regeneradora. Aqui, apresentamos um protocolo simples, rápido e eficiente para a entrega de siRNA mediada por dendrímeros e silenciamento de genes no coração adulto zebrafish regeneradora. Este método fornece uma abordagem alternativa para determinar as funções do gene em órgãos adultos no zebrafish e pode ser estendido para outros organismos modelo também.
Introduction
Infarto do miocárdio tornou-se uma ameaça de saúde, levando a um enorme fardo econômico ao redor do mundo1. O coração dos mamíferos adulto falha regenerar e reabastecer o cardiomyocytes perdido na escala macroscópica após a lesão, levando à formação de cicatriz tecidos e subsequente insuficiência cardíaca. Ao contrário dos mamíferos, o peixe-zebra é capaz de regeneração do coração, principalmente através da proliferação robusta miocárdica após diferentes tipos de lesão do coração, tornando-se um organismo modelo ideal para investigar os mecanismos moleculares da regeneração do coração 2,3,4,5,6,7,8. Decifrando os mecanismos endógenos regeneração de coração de zebrafish subjacente é uma excitante área de pesquisa na busca de novas estratégias terapêuticas melhorar a regeneração de coração humano9.
Métodos de manipulação genética estão disponíveis no zebrafish. Estes consistem de morpholinos (MO) que são também amplamente utilizados em rãs, pintinho e mamíferos além no zebrafish10,11,12,13. MO tem eficiente nocaute da expressão do gene alvo no zebrafish Adulto barbatana, cérebro e retina14,15,16,17,18,19. Ácido nucleico bloqueado (LNA) é outro oligonucleotide artificial usada para derrubar a expressão do gene endógeno não apenas em embriões de peixe-zebra, mas também em órgãos de animais adultos20,21,22, 23 , 24. no entanto, a falta de métodos eficazes de perda-de-função para corações dos adultos continua a ser um obstáculo no estudo dos mecanismos moleculares de regeneração do órgão. No presentes, pequeno-molécula inibidores ou expressão transgênica dominante negativo mutantes são principalmente usados para bloquear a função de um determinado gene ou caminho para estudar a sua função no zebrafish adulto coração regeneração25,26 ,,27. No entanto, nem todos os genes e vias de sinalização são aplicáveis para esses métodos.
Interferindo de pequenos RNAs (siRNAs) são amplamente utilizados para a análise de perda-de-função de células de mamíferos e embriões de organismos-modelo, bem como órgãos adultos para estudos pré-clínicos em animais modelos28,29,30 , 31 , 32. siRNAs foram efetivamente usadas para silenciar genes em tumores33,34,35 e em cardiomyocytes36,37,38,39 ,40 através de diferentes sistemas de entrega. Recentemente, desenvolvemos eficientes encapsulado siRNA nanoparticle-silenciamento de genes no coração adulto regeneradora usando vários diferentes nanopartículas41,42,43, fornecendo uma nova ferramenta para estudos funcionais de genes em órgãos adultos do zebrafish. Baseado em nossos anteriores estudos41,42,43, aqui apresentamos um protocolo simples, prático, e potente para siRNA silenciamento no coração adulto zebrafish regeneradora usando f-PAMAM-PEG-R9 dendrímeros. Aldh1a2 (aldeído desidrogenase 1, membro da família A2) gene foi upregulated após a ressecção do ápice de zebrafish e ablação de Aldh1a2 bloqueou a regeneração cardíaca44. Aqui tomamos aldh1a2 gene como um exemplo para testar a eficiência de gene “knockdown” mediada pela injeção de siRNA nanoparticle-encapsulado. Este protocolo contém um procedimento para ressecção de coração zebrafish, síntese química de nanopartículas e um método de entrega sobre nanopartículas siRNA-encapsulado no coração de adultos do zebrafish.
Protocol
Representative Results
Discussion
O peixe-zebra é plenamente capaz de regenerar uma variedade de órgãos, incluindo o coração adulto5. Enquanto métodos genéticos e transgênicos são bem desenvolvidos para estudar funções de genes em embriões de peixe-zebra, os investigadores ainda são confrontados com a difícil tarefa de geração de alelos mutantes condicionais no zebrafish45,46. Assim, a transgênicos dominante negativo mutantes ou inibidores da pequeno-molé…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores agradecer Dr. IC Bruce comentários críticos e ler o manuscrito. Este trabalho foi financiado por doações da Nacional Natural Science Foundation da China (31430059, 31701272, 31730061, 81470399 e 31521062), AstraZeneca, Ásia e emergente mercado inovador medicina e desenvolvimento precoce.
Materials
| tricaine | Sigma | E10521 | Store at 4°C |
| stereomicroscope | Leica | S8AP0 | |
| sharp forcep | WPI | 14098 | |
| iridectomy scissors | WPI | 501778 | |
| elbow tweezers | Suzhou Liuliu | SE05Cr | |
| α,ω-dipyridyl disulfido polyethylene glycol(Py-PEG-Py) | Biomatrik (Jiaxing) Inc. | 5239 | |
| core of G4.0 polyamidoamine (PAMAM) | Andrews ChemServices | AuCS-297 | |
| vacuum drying equipment | Yiheng | DZF-6020 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Gibco | 14190144 | |
| tris(2-carboxyethyl)phosphine(TCEP) | Alfar Aesar | 51805-45-9 | Causes severe skin burns and eye damage. Causes serious eye damage. |
| ultrafiltration tube | Millipore | UFC900308 | |
| freeze dryer | Martin Christ | Alpha 2-4 Ldplus | |
| NMR spectrometer | Bruker | AV400 | |
| Deuterium oxide(D2O) | J&K | 174611 | |
| NMR sample tube | J&K | WG-1000-7-50 | |
| 3 kDa MWCO ultrafiltration tube | Merck | UFC900308 | |
| sea salts | Instant Ocean® | SS15-10 |
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