JoVE Journal > Developmental Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Developmental Biology

Nanopartikler-medieret siRNA genhæmning i voksen zebrafisk hjerte

Published: July 29, 2018
doi:
10.3791/58054
, , , , ,
1Beijing Key Laboratory of Cardiometabolic Molecular Medicine, State Key Laboratory of Natural and Biomimetic Drugs, Institute of Molecular Medicine,Peking University, 2Department of Biomedical Engineering, College of Engineering,Peking University

Summary

Det er fortsat en stor udfordring at udvikle betinget af gen-knockout eller effektiv af gen-knockdown i voksen zebrafisk organer. Her rapporterer vi en protokol for udfører nanopartikel-medieret siRNA genhæmning i voksen zebrafisk hjertet, hvilket giver en ny tab af funktion metode til at studere voksen organer i zebrafisk og andre modelorganismer.

Abstract

Pattedyr har en meget begrænset kapacitet til at regenerere hjertet efter myokardieinfarkt. På den anden side regenererer den voksne zebrafisk sit hjerte efter apex resektion eller cryoinjury, hvilket gør det en vigtig model organisme for hjertet regenerering undersøgelse. Manglen på tab af funktion metoder for voksne organer har imidlertid begrænset indsigt i de underliggende hjerte regenerering mekanismer. RNA-interferens via forskellige leveringssystemer er et kraftfuldt værktøj til silencing gener i pattedyrsceller og modelorganismer. Vi har tidligere rapporteret at siRNA-indkapslede nanopartikler med held angive celler og resultere i en bemærkelsesværdig gen-specifikke knockdown i regenererende voksen zebrafisk hjertet. Her præsenterer vi en enkel, hurtig og effektiv protokol for dendrimer-medieret siRNA levering og genhæmning regenererende voksen zebrafisk midt. Denne metode giver en alternativ metode til bestemmelse af genet funktioner i voksen organer i zebrafisk og kan udvides til at omfatte andre modelorganismer så godt.

Introduction

Myokardieinfarkt er blevet en stor sundhedstrussel, fører til en enorm økonomisk byrde omkring verden1. Den voksne pattedyr hjerte undlader at regenerere og genopbygge den tabte cardiomyocytes på en makroskopisk skala efter den skade, hvilket fører til dannelsen af ar væv og efterfølgende hjertesvigt. I modsætning til pattedyr er zebrafisk i stand til at hjertet regenerering, primært gennem robust Myokardie spredning efter forskellige typer af hjerte skade, hvilket gør det en ideel model organisme for at undersøge de molekylære mekanismer af hjertet regenerering 2,3,4,5,6,7,8. Decifrere de endogene mekanismer er underliggende zebrafisk hjerte regenerering et spændende område for forskning i søgningen for nye terapeutiske strategier til at forbedre menneskers hjerte regenerering9.

Genetisk manipulation metoder er tilgængelige i zebrafisk. Disse består af morpholinos (MO), er også meget udbredt i frøer, kylling og pattedyr udover i zebrafisk10,11,12,13. MO har effektive knockdown af target genekspression i voksen zebrafisk fin, hjernen og nethinden14,15,16,17,18,19. Låst-nucleic acid (LNA) er en anden kunstig oligonukleotid bruges til at banke ned endogene genekspression i zebrafisk embryoner, men også i voksne dyrs organer20,21,22,, 23 , 24. dog manglen på effektive tab af funktion metoder for voksnes hjerter stadig en hindring i at studere de molekylære mekanismer af orgel regeneration. På nuværende, små-molekyle hæmmere eller transgene udtryk for dominerende-negative mutanter bruges primært til at blokere funktionen af et bestemt gen eller vej at undersøge dets funktion i voksen zebrafisk hjerte regenerering25,26 ,27. Dog ikke alle gener eller signaling veje er gældende for disse metoder.

Blander sig små RNA’er (siRNAs) er almindeligt anvendt til analysen af tab af funktion i pattedyrsceller og embryoner af modelorganismer samt voksne organer efter prækliniske undersøgelser i dyr modeller28,29,30 , 31 , 32. siRNAs har brugt effektivt til tavshed gener i tumorer33,34,35 og cardiomyocytes36,37,38,39 ,40 via forskellige leveringssystemer. For nylig har udviklet vi effektive siRNA-indkapslede nanopartikel genhæmning i regenererende voksen hjertet ved hjælp af flere forskellige nanopartikler41,42,43, giver et nyt værktøj til funktionelle studier af gener i voksen zebrafisk organer. Baseret på vores tidligere undersøgelser41,42,43, her vil vi præsentere en enkel, praktisk, men kraftfuld protokol for siRNA genhæmning i regenererende voksen zebrafisk hjertet ved hjælp af f-PAMAM-PIND-R9 dendrimers. Aldh1a2 (aldehyd dehydrogenase 1, familiemedlem A2) gen var upregulated efter zebrafisk apex resektion og ablation af Aldh1a2 blokeret hjerte regenerering44. Her tager vi aldh1a2 genet som et eksempel at teste gen knockdown effektivitet medieret af nanopartikler-indkapslede siRNA injektion. Denne protokol indeholder en procedure for zebrafisk hjerte resektion, kemisk syntese af nanopartikler og en leveringsmetode på siRNA-indkapslede nanopartikler i voksen zebrafisk hjerte.

Protocol

Alle dyr procedurer bruges en zebrafisk protokol godkendes af det institutionelle Animal Care og brug udvalg ved Peking University, som er fuldt ud godkendt af Association for evaluering og akkreditering af Laboratory Animal Care. 1. forberedelse af Tricaine løsning For at forberede tricaine stamopløsning, tilføje 400 mg ethyl 3-aminobenzoat methanesulfonate pulver til 97,9 mL destilleret vand og derefter tilsættes 2,1 mL 1 M Tris (pH 9.5) til at justere pH ~ 7. Butik stamopløsn…

Representative Results

For at bestemme effektiviteten af dendrimer-medieret siRNA levering, vi resektion apex af ventrikel zebrafisk hjerte, derefter injiceres 10 µL af dendrimer kun (mock gruppe), Cy5-siRNA kun (nøgen gruppe) eller f-PAMAM-PIND-R9 dendrimer-indkapslede Cy5-siRNA (Cy5-siRNA gruppe) intrapleurally, henholdsvis (figur 2A-B). Fluorescens signal var påvises i hjerter sprøjtes med dendrimer-indkapslede Cy5-siRNA på 3, 24 og 48 hpi (timer efter inje…

Discussion

For zebrafisk er fuldt ud i stand til at regenerere en række organer, herunder voksen hjerte5. Mens transgene og genetiske metoder er veludviklet for at studere genet funktioner i embryoner fra zebrafisk, efterforskere stadig over for en skræmmende opgave at generere betinget mutante alleler i zebrafisk45,46. Således transgene dominerende-negative mutanter eller små-molekyle hæmmere bruges ofte til adresse genet funktioner i voksen ze…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Forfatterne takke Dr. IC Bruce for kritiske kommentarer og læsning af manuskript. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Natural Science Foundation of China (31430059, 31701272, 31730061, 81470399 og 31521062), AstraZeneca Asien og Emerging Market innovativ medicin og tidlige udvikling.

Materials

tricaine Sigma E10521 Store at 4°C
stereomicroscope Leica  S8AP0
sharp forcep WPI 14098
iridectomy scissors WPI 501778
elbow tweezers Suzhou Liuliu SE05Cr
α,ω-dipyridyl disulfido polyethylene glycol(Py-PEG-Py) Biomatrik (Jiaxing) Inc. 5239
core of G4.0 polyamidoamine (PAMAM) Andrews ChemServices AuCS-297
vacuum drying equipment Yiheng DZF-6020
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) Gibco 14190144
tris(2-carboxyethyl)phosphine(TCEP) Alfar Aesar 51805-45-9 Causes severe skin burns and eye damage. Causes serious eye damage.
ultrafiltration tube Millipore UFC900308
freeze dryer Martin Christ Alpha 2-4 Ldplus
NMR spectrometer Bruker AV400
Deuterium oxide(D2O) J&K 174611
NMR sample tube J&K WG-1000-7-50
3 kDa MWCO ultrafiltration tube Merck UFC900308
sea salts Instant Ocean® SS15-10
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Writing Group Members. Executive Summary: Heart Disease and Stroke Statistics–2016 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 133 (4), 447-454 (2016).
  2. Chablais, F., Veit, J., Rainer, G., Jazwinska, A. The zebrafish heart regenerates after cryoinjury-induced myocardial infarction. BMC Dev Biol. 11, 21 (2011).
  3. Gonzalez-Rosa, J. M., Martin, V., Peralta, M., Torres, M., Mercader, N. Extensive scar formation and regression during heart regeneration after cryoinjury in zebrafish. Development. 138 (9), 1663-1674 (2011).
  4. Parente, V., et al. Hypoxia/reoxygenation cardiac injury and regeneration in zebrafish adult heart. PLoS One. 8 (1), 53748 (2013).
  5. Poss, K. D., Wilson, L. G., Keating, M. T. Heart regeneration in zebrafish. Science. 298 (5601), 2188-2190 (2002).
  6. Raya, A., et al. Activation of Notch signaling pathway precedes heart regeneration in zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 11889-11895 (2003).
  7. Schnabel, K., Wu, C. C., Kurth, T., Weidinger, G. Regeneration of cryoinjury induced necrotic heart lesions in zebrafish is associated with epicardial activation and cardiomyocyte proliferation. PLoS One. 6 (4), 18503 (2011).
  8. Wang, J., et al. The regenerative capacity of zebrafish reverses cardiac failure caused by genetic cardiomyocyte depletion. Development. 138 (16), 3421-3430 (2011).
  9. Gonzalez-Rosa, J. M., Burns, C. E., Burns, C. G. Zebrafish heart regeneration: 15 years of discoveries. Regeneration (Oxf). 4 (3), 105-123 (2017).
  10. Heasman, J., Kofron, M., Wylie, C. Beta-catenin signaling activity dissected in the early Xenopus embryo: a novel antisense approach. Dev Biol. 222 (1), 124-134 (2000).
  11. Nasevicius, A., Ekker, S. C. Effective targeted gene ‘knockdown’ in zebrafish. Nat Genet. 26 (2), 216-220 (2000).
  12. Coonrod, S. A., Bolling, L. C., Wright, P. W., Visconti, P. E., Herr, J. C. A morpholino phenocopy of the mouse mos mutation. Genesis. 30 (3), 198-200 (2001).
  13. London, C. A., et al. A novel antisense inhibitor of MMP-9 attenuates angiogenesis, human prostate cancer cell invasion and tumorigenicity. Cancer Gene Ther. 10 (11), 823-832 (2003).
  14. Kizil, C., Otto, G. W., Geisler, R., Nusslein-Volhard, C., Antos, C. L. Simplet controls cell proliferation and gene transcription during zebrafish caudal fin regeneration. Dev Biol. 325 (2), 329-340 (2009).
  15. Thummel, R., et al. Inhibition of zebrafish fin regeneration using in vivo. electroporation of morpholinos against fgfr1 and msxb. Dev Dyn. 235 (2), 336-346 (2006).
  16. Kizil, C., Brand, M. Cerebroventricular microinjection (CVMI) into adult zebrafish brain is an efficient misexpression method for forebrain ventricular cells. PLoS One. 6 (11), 27395 (2011).
  17. Kizil, C., Iltzsche, A., Kaslin, J., Brand, M. Micromanipulation of gene expression in the adult zebrafish brain using cerebroventricular microinjection of morpholino oligonucleotides. J Vis Exp. (75), e50415 (2013).
  18. Craig, S. E., et al. The zebrafish galectin Drgal1-l2 is expressed by proliferating Muller glia and photoreceptor progenitors and regulates the regeneration of rod photoreceptors. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (6), 3244-3252 (2010).
  19. Thummel, R., Bailey, T. J., Hyde, D. R. In vivo electroporation of morpholinos into the adult zebrafish retina. J Vis Exp. (58), e3603 (2011).
  20. Rayburn, E. R., Zhang, R. Antisense, RNAi and gene silencing strategies for therapy: mission possible or impossible. Drug Discov Today. 13 (11-12), 513-521 (2008).
  21. Seth, P. P., et al. Short antisense oligonucleotides with novel 2′-4′ conformationaly restricted nucleoside analogues show improved potency without increased toxicity in animals. J Med Chem. 52 (1), 10-13 (2009).
  22. Prakash, T. P., et al. Antisense oligonucleotides containing conformationally constrained 2′,4′-(N-methoxy)aminomethylene and 2′,4′-aminooxymethylene and 2′-O,4′-C-aminomethylene bridged nucleoside analogues show improved potency in animal models. J Med Chem. 53 (4), 1636-1650 (2010).
  23. Yamamoto, T., Nakatani, M., Narukawa, K., Obika, S. Antisense drug discovery and development. Future Med Chem. 3 (3), 339-365 (2011).
  24. Itoh, M., Nakaura, M., Imanishi, T., Obika, S. Target gene knockdown by 2′,4′-BNA/LNA antisense oligonucleotides in zebrafish. Nucleic Acid Ther. 24 (3), 186-191 (2014).
  25. Han, P., et al. Hydrogen peroxide primes heart regeneration with a derepression mechanism. Cell Res. 24 (9), 1091-1107 (2014).
  26. Jopling, C., et al. Zebrafish heart regeneration occurs by cardiomyocyte dedifferentiation and proliferation. Nature. 464 (7288), 606-609 (2010).
  27. Lepilina, A., et al. A dynamic epicardial injury response supports progenitor cell activity during zebrafish heart regeneration. Cell. 127 (3), 607-619 (2006).
  28. McManus, M. T., Sharp, P. A. Gene silencing in mammals by small interfering RNAs. Nat Rev Genet. 3 (10), 737-747 (2002).
  29. de Fougerolles, A., Vornlocher, H. P., Maraganore, J., Lieberman, J. Interfering with disease: a progress report on siRNA-based therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 6 (6), 443-453 (2007).
  30. Kim, D. H., Rossi, J. J. Strategies for silencing human disease using RNA interference. Nat Rev Genet. 8 (3), 173-184 (2007).
  31. McCaffrey, A. P., et al. Inhibition of hepatitis B virus in mice by RNA interference. Nat Biotechnol. 21 (6), 639-644 (2003).
  32. Raoul, C., et al. Lentiviral-mediated silencing of SOD1 through RNA interference retards disease onset and progression in a mouse model of ALS. Nat Med. 11 (4), 423-428 (2005).
  33. Hu-Lieskovan, S., Heidel, J. D., Bartlett, D. W., Davis, M. E., Triche, T. J. Sequence-specific knockdown of EWS-FLI1 by targeted, nonviral delivery of small interfering RNA inhibits tumor growth in a murine model of metastatic Ewing’s sarcoma. Cancer Res. 65 (19), 8984-8992 (2005).
  34. Schiffelers, R. M., et al. Cancer siRNA therapy by tumor selective delivery with ligand-targeted sterically stabilized nanoparticle. Nucleic Acids Res. 32 (19), 149 (2004).
  35. Yang, X. Z., et al. Systemic delivery of siRNA with cationic lipid assisted PEG-PLA nanoparticles for cancer therapy. J Control Release. 156 (2), 203-211 (2011).
  36. Ko, Y. T., Hartner, W. C., Kale, A., Torchilin, V. P. Gene delivery into ischemic myocardium by double-targeted lipoplexes with anti-myosin antibody and TAT peptide. Gene Ther. 16 (1), 52-59 (2009).
  37. Liu, J., et al. Functionalized dendrimer-based delivery of angiotensin type 1 receptor siRNA for preserving cardiac function following infarction. Biomaterials. 34 (14), 3729-3736 (2013).
  38. Nam, H. Y., Kim, J., Kim, S. W., Bull, D. A. Cell targeting peptide conjugation to siRNA polyplexes for effective gene silencing in cardiomyocytes. Mol Pharm. 9 (5), 1302-1309 (2012).
  39. Nam, H. Y., McGinn, A., Kim, P. H., Kim, S. W., Bull, D. A. Primary cardiomyocyte-targeted bioreducible polymer for efficient gene delivery to the myocardium. Biomaterials. 31 (31), 8081-8087 (2010).
  40. Won, Y. W., McGinn, A. N., Lee, M., Bull, D. A., Kim, S. W. Targeted gene delivery to ischemic myocardium by homing peptide-guided polymeric carrier. Mol Pharm. 10 (1), 378-385 (2013).
  41. Diao, J., et al. PEG-PLA nanoparticles facilitate siRNA knockdown in adult zebrafish heart. Dev Biol. 406 (2), 196-202 (2015).
  42. Xiao, C., et al. Chromatin-remodelling factor Brg1 regulates myocardial proliferation and regeneration in zebrafish. Nat Commun. 7, 13787 (2016).
  43. Wang, F., et al. A Neutralized Noncharged Polyethylenimine-Based System for Efficient Delivery of siRNA into Heart without Toxicity. ACS Appl Mater Interfaces. 8 (49), 33529-33538 (2016).
  44. Kikuchi, K., et al. Retinoic acid production by endocardium and epicardium is an injury response essential for zebrafish heart regeneration. Dev Cell. 20 (3), 397-404 (2011).
  45. Hoshijima, K., Jurynec, M. J., Grunwald, D. J. Precise Editing of the Zebrafish Genome Made Simple and Efficient. Dev Cell. 36 (6), 654-667 (2016).
  46. Zu, Y., et al. TALEN-mediated precise genome modification by homologous recombination in zebrafish. Nat Methods. 10 (4), 329-331 (2013).
  47. Kesharwani, P., Gajbhiye, V., Jain, N. K. A review of nanocarriers for the delivery of small interfering RNA. Biomaterials. 33 (29), 7138-7150 (2012).
  48. Luong, D., et al. PEGylated PAMAM dendrimers: Enhancing efficacy and mitigating toxicity for effective anticancer drug and gene delivery. Acta Biomater. 43, 14-29 (2016).
  49. Luo, K., He, B., Wu, Y., Shen, Y., Gu, Z. Functional and biodegradable dendritic macromolecules with controlled architectures as nontoxic and efficient nanoscale gene vectors. Biotechnol Adv. 32 (4), 818-830 (2014).
  50. Shcharbin, D., Shakhbazau, A., Bryszewska, M. Poly(amidoamine) dendrimer complexes as a platform for gene delivery. Expert Opin Drug Deliv. 10 (12), 1687-1698 (2013).

Tags

NanoparticleSiRNAGene-silencingZebrafishHeart RegenerationVentricular ResectionPAM Nanoparticle DendrimerALDH1A2 SiRNAScrambled Negative Control SiRNACyanine DyesAnesthesiaSurgeryRecovery
check_url/58054?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Xiao, C., Wang, F., Hou, J., Zhu, X., Luo, Y., Xiong, J. Nanoparticle-mediated siRNA Gene-silencing in Adult Zebrafish Heart. J. Vis. Exp. (137), e58054, doi:10.3791/58054 (2018).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image