वयस्क Zebrafish दिल में Nanoparticle-मध्यस्थता सिरना जीन-मुंह बंद करने
Summary
वयस्क zebrafish अंगों में सशर्त जीन-नॉकआउट या प्रभावी जीन-पछाड़ना विकसित करना एक प्रमुख चुनौती बनी हुई है. यहाँ हम वयस्क zebrafish दिल में nanoparticle मध्यस्थता सिरना जीन-मुंह बंद करने प्रदर्शन के लिए एक प्रोटोकॉल की रिपोर्ट, इस प्रकार zebrafish और अन्य मॉडल जीवों में वयस्क अंगों के अध्ययन के लिए एक नया नुकसान की समारोह विधि प्रदान करते हैं.
Abstract
स्तनधारी हृदय को रोधगलन के बाद पुनर्जीवित करने की बहुत सीमित क्षमता होती है । दूसरी ओर, वयस्क zebrafish शीर्ष लकीर या cryoinjury के बाद अपने दिल पुनर्जीवित, यह दिल पुनर्जनन अध्ययन के लिए एक महत्वपूर्ण मॉडल जीव बना । हालांकि, वयस्क अंगों के लिए हानि के समारोह तरीकों की कमी के कारण हृदय पुनर्जनन तंत्र में अंतर्दृष्टि सीमित है । विभिन्न वितरण प्रणालियों के माध्यम से आरएनए हस्तक्षेप स्तनधारी कोशिकाओं और मॉडल जीवों में मुंह बंद करने जीन के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है । हमने पहले बताया है कि सिरना-encapsulated नैनोकणों सफलतापूर्वक regenerating वयस्क zebrafish दिल में एक उल्लेखनीय जीन विशिष्ट पछाड़ना में कोशिकाओं और परिणाम दर्ज करें । यहां, हम dendrimer के लिए एक सरल, तेजी से, और कुशल प्रोटोकॉल प्रस्तुत वयस्क zebrafish दिल में मध्यस्थता सिरना वितरण और जीन मुंह बंद करने । इस विधि zebrafish में वयस्क अंगों में जीन कार्यों का निर्धारण करने के लिए एक वैकल्पिक दृष्टिकोण प्रदान करता है और अंय मॉडल जीवों के लिए भी बढ़ाया जा सकता है ।
Introduction
रोधगलन एक प्रमुख स्वास्थ्य खतरा बन गया है, दुनिया भर में एक जबरदस्त आर्थिक बोझ के लिए अग्रणी1। वयस्क स्तनधारी दिल को पुनर्जीवित करने और चोट के बाद एक macroscopic पैमाने पर खो cardiomyocytes की भरपाई करने में विफल रहता है, निशान ऊतकों और बाद में दिल की विफलता के गठन के लिए अग्रणी । स्तनधारियों के विपरीत, zebrafish दिल पुनर्जनन के लिए सक्षम है, मुख्य रूप से मजबूत रोधगलन के माध्यम से दिल की चोट के विभिन्न प्रकार के बाद, यह हृदय उत्थान के आणविक तंत्र की जांच के लिए एक आदर्श मॉडल जीव बना रही है 2,3,4,5,6,7,8. अंतर्जात zebrafish हृदय पुनर्जनन अंतर्निहित तंत्र को समझने के उपंयास चिकित्सीय रणनीतियों के लिए खोज में अनुसंधान के एक रोमांचक क्षेत्र के लिए मानव हृदय9उत्थान में सुधार है ।
आनुवंशिक हेरफेर तरीकों zebrafish में उपलब्ध हैं । ये morpholinos (मो) कि भी व्यापक रूप से मेंढक, चूजा, और zebrafish में10,11,12,13के अलावा स्तनधारियों में इस्तेमाल किया जाता है से मिलकर बनता है । मो वयस्क zebrafish फिन, मस्तिष्क, और रेटिना14,15,16,17,18,19में लक्ष्य जीन अभिव्यक्ति की कुशल पछाड़ना है । बंद-न्यूक्लिक एसिड (LNA) एक और कृत्रिम oligonucleotide न केवल zebrafish भ्रूण में अंतर्जात जीन अभिव्यक्ति नीचे दस्तक करने के लिए इस्तेमाल किया है, लेकिन यह भी वयस्क पशु अंगों में20,21,22, 23 , 24. हालांकि, ‘ वयस्कों के दिलों के लिए प्रभावी हानि के समारोह तरीकों की कमी अंग पुनर्जनन के आणविक तंत्र का अध्ययन करने में एक बाधा बनी हुई है । वर्तमान में, छोटे अणु अवरोधकों या प्रमुख नकारात्मक म्यूटेंट के ट्रांसजेनिक अभिव्यक्ति मुख्य रूप से एक निश्चित जीन या मार्ग के समारोह को ब्लॉक करने के लिए उपयोग किया जाता है वयस्क zebrafish दिल पुनर्जनन25,26 में अपने समारोह का अध्ययन ,27. हालांकि, नहीं सभी जीन या संकेत रास्ते इन तरीकों के लिए लागू होते हैं ।
छोटे हस्तक्षेप RNAs (siRNAs) व्यापक रूप से स्तनधारी कोशिकाओं और मॉडल जीवों के भ्रूण में हानि-समारोह विश्लेषण के लिए उपयोग किया जाता है, साथ ही पशु मॉडल में नैदानिक अध्ययन के लिए वयस्क अंगों28,29,30 , 31 , ३२. siRNAs प्रभावीढंग से ट्यूमर३३,३४,३५ और cardiomyocytes३६,३७,३८,३९ में जीन मौन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है ,४० विभिंन वितरण प्रणालियों के माध्यम से । हाल ही में, हम कुशल सिरना-encapsulated nanoparticle जीन मुंह बंद करने-regenerating वयस्क दिल में कई अलग नैनोकणों४१,४२,४३का उपयोग कर विकसित, के लिए एक उपंयास उपकरण प्रदान वयस्क zebrafish अंगों में जीन के कार्यात्मक अध्ययन । हमारे पिछले अध्ययन४१,४२,४३के आधार पर, यहां हम सिरना जीन के लिए एक सरल, व्यावहारिक, अभी तक शक्तिशाली प्रोटोकॉल वर्तमान-मुंह बंद करने वयस्क zebrafish दिल में एफ पमम-खूंटी-R9 का उपयोग कर dendrimers । Aldh1a2 (एल्डिहाइड डिहाइड्रोजनेज 1 परिवार, सदस्य A2) जीन zebrafish एपेक्स लकीर और Aldh1a2 के पृथक के बाद अनियमित था हृदय पुनर्जनन४४अवरुद्ध । यहां हम एक उदाहरण के रूप में जीन पछाड़ना दक्षता nanoparticle-encapsulated सिरना इंजेक्शन द्वारा मध्यस्थता परीक्षण के रूप में aldh1a2 जीन ले । इस प्रोटोकॉल zebrafish दिल लकीर, नैनोकणों के रासायनिक संश्लेषण के लिए एक प्रक्रिया है, और सिरना पर एक प्रसव विधि-encapsulated नैनोकणों वयस्क zebrafish दिल में शामिल हैं ।
Protocol
Representative Results
Discussion
zebrafish वयस्क दिल5सहित अंगों की एक किस्म को फिर से पैदा करने में पूरी तरह से सक्षम है । जबकि ट्रांसजेनिक और आनुवंशिक तरीके अच्छी तरह से zebrafish के भ्रूण में जीन कार्यों का अध्ययन करने के लिए विकसित कर र?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों गंभीर टिप्पणी के लिए डॉ आईसी ब्रूस धंयवाद और पांडुलिपि पढ़ने । यह काम चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (३१४३००५९, ३१७०१२७२, ३१७३००६१, ८१४७०३९९, और ३१५२१०६२), AstraZeneca एशिया, और उभरते बाजार अभिनव चिकित्सा और जल्दी विकास से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था ।
Materials
| tricaine | Sigma | E10521 | Store at 4°C |
| stereomicroscope | Leica | S8AP0 | |
| sharp forcep | WPI | 14098 | |
| iridectomy scissors | WPI | 501778 | |
| elbow tweezers | Suzhou Liuliu | SE05Cr | |
| α,ω-dipyridyl disulfido polyethylene glycol(Py-PEG-Py) | Biomatrik (Jiaxing) Inc. | 5239 | |
| core of G4.0 polyamidoamine (PAMAM) | Andrews ChemServices | AuCS-297 | |
| vacuum drying equipment | Yiheng | DZF-6020 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Gibco | 14190144 | |
| tris(2-carboxyethyl)phosphine(TCEP) | Alfar Aesar | 51805-45-9 | Causes severe skin burns and eye damage. Causes serious eye damage. |
| ultrafiltration tube | Millipore | UFC900308 | |
| freeze dryer | Martin Christ | Alpha 2-4 Ldplus | |
| NMR spectrometer | Bruker | AV400 | |
| Deuterium oxide(D2O) | J&K | 174611 | |
| NMR sample tube | J&K | WG-1000-7-50 | |
| 3 kDa MWCO ultrafiltration tube | Merck | UFC900308 | |
| sea salts | Instant Ocean® | SS15-10 |
References
- Writing Group Members. Executive Summary: Heart Disease and Stroke Statistics–2016 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 133 (4), 447-454 (2016).
- Chablais, F., Veit, J., Rainer, G., Jazwinska, A. The zebrafish heart regenerates after cryoinjury-induced myocardial infarction. BMC Dev Biol. 11, 21 (2011).
- Gonzalez-Rosa, J. M., Martin, V., Peralta, M., Torres, M., Mercader, N. Extensive scar formation and regression during heart regeneration after cryoinjury in zebrafish. Development. 138 (9), 1663-1674 (2011).
- Parente, V., et al. Hypoxia/reoxygenation cardiac injury and regeneration in zebrafish adult heart. PLoS One. 8 (1), 53748 (2013).
- Poss, K. D., Wilson, L. G., Keating, M. T. Heart regeneration in zebrafish. Science. 298 (5601), 2188-2190 (2002).
- Raya, A., et al. Activation of Notch signaling pathway precedes heart regeneration in zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 11889-11895 (2003).
- Schnabel, K., Wu, C. C., Kurth, T., Weidinger, G. Regeneration of cryoinjury induced necrotic heart lesions in zebrafish is associated with epicardial activation and cardiomyocyte proliferation. PLoS One. 6 (4), 18503 (2011).
- Wang, J., et al. The regenerative capacity of zebrafish reverses cardiac failure caused by genetic cardiomyocyte depletion. Development. 138 (16), 3421-3430 (2011).
- Gonzalez-Rosa, J. M., Burns, C. E., Burns, C. G. Zebrafish heart regeneration: 15 years of discoveries. Regeneration (Oxf). 4 (3), 105-123 (2017).
- Heasman, J., Kofron, M., Wylie, C. Beta-catenin signaling activity dissected in the early Xenopus embryo: a novel antisense approach. Dev Biol. 222 (1), 124-134 (2000).
- Nasevicius, A., Ekker, S. C. Effective targeted gene ‘knockdown’ in zebrafish. Nat Genet. 26 (2), 216-220 (2000).
- Coonrod, S. A., Bolling, L. C., Wright, P. W., Visconti, P. E., Herr, J. C. A morpholino phenocopy of the mouse mos mutation. Genesis. 30 (3), 198-200 (2001).
- London, C. A., et al. A novel antisense inhibitor of MMP-9 attenuates angiogenesis, human prostate cancer cell invasion and tumorigenicity. Cancer Gene Ther. 10 (11), 823-832 (2003).
- Kizil, C., Otto, G. W., Geisler, R., Nusslein-Volhard, C., Antos, C. L. Simplet controls cell proliferation and gene transcription during zebrafish caudal fin regeneration. Dev Biol. 325 (2), 329-340 (2009).
- Thummel, R., et al. Inhibition of zebrafish fin regeneration using in vivo. electroporation of morpholinos against fgfr1 and msxb. Dev Dyn. 235 (2), 336-346 (2006).
- Kizil, C., Brand, M. Cerebroventricular microinjection (CVMI) into adult zebrafish brain is an efficient misexpression method for forebrain ventricular cells. PLoS One. 6 (11), 27395 (2011).
- Kizil, C., Iltzsche, A., Kaslin, J., Brand, M. Micromanipulation of gene expression in the adult zebrafish brain using cerebroventricular microinjection of morpholino oligonucleotides. J Vis Exp. (75), e50415 (2013).
- Craig, S. E., et al. The zebrafish galectin Drgal1-l2 is expressed by proliferating Muller glia and photoreceptor progenitors and regulates the regeneration of rod photoreceptors. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (6), 3244-3252 (2010).
- Thummel, R., Bailey, T. J., Hyde, D. R. In vivo electroporation of morpholinos into the adult zebrafish retina. J Vis Exp. (58), e3603 (2011).
- Rayburn, E. R., Zhang, R. Antisense, RNAi and gene silencing strategies for therapy: mission possible or impossible. Drug Discov Today. 13 (11-12), 513-521 (2008).
- Seth, P. P., et al. Short antisense oligonucleotides with novel 2′-4′ conformationaly restricted nucleoside analogues show improved potency without increased toxicity in animals. J Med Chem. 52 (1), 10-13 (2009).
- Prakash, T. P., et al. Antisense oligonucleotides containing conformationally constrained 2′,4′-(N-methoxy)aminomethylene and 2′,4′-aminooxymethylene and 2′-O,4′-C-aminomethylene bridged nucleoside analogues show improved potency in animal models. J Med Chem. 53 (4), 1636-1650 (2010).
- Yamamoto, T., Nakatani, M., Narukawa, K., Obika, S. Antisense drug discovery and development. Future Med Chem. 3 (3), 339-365 (2011).
- Itoh, M., Nakaura, M., Imanishi, T., Obika, S. Target gene knockdown by 2′,4′-BNA/LNA antisense oligonucleotides in zebrafish. Nucleic Acid Ther. 24 (3), 186-191 (2014).
- Han, P., et al. Hydrogen peroxide primes heart regeneration with a derepression mechanism. Cell Res. 24 (9), 1091-1107 (2014).
- Jopling, C., et al. Zebrafish heart regeneration occurs by cardiomyocyte dedifferentiation and proliferation. Nature. 464 (7288), 606-609 (2010).
- Lepilina, A., et al. A dynamic epicardial injury response supports progenitor cell activity during zebrafish heart regeneration. Cell. 127 (3), 607-619 (2006).
- McManus, M. T., Sharp, P. A. Gene silencing in mammals by small interfering RNAs. Nat Rev Genet. 3 (10), 737-747 (2002).
- de Fougerolles, A., Vornlocher, H. P., Maraganore, J., Lieberman, J. Interfering with disease: a progress report on siRNA-based therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 6 (6), 443-453 (2007).
- Kim, D. H., Rossi, J. J. Strategies for silencing human disease using RNA interference. Nat Rev Genet. 8 (3), 173-184 (2007).
- McCaffrey, A. P., et al. Inhibition of hepatitis B virus in mice by RNA interference. Nat Biotechnol. 21 (6), 639-644 (2003).
- Raoul, C., et al. Lentiviral-mediated silencing of SOD1 through RNA interference retards disease onset and progression in a mouse model of ALS. Nat Med. 11 (4), 423-428 (2005).
- Hu-Lieskovan, S., Heidel, J. D., Bartlett, D. W., Davis, M. E., Triche, T. J. Sequence-specific knockdown of EWS-FLI1 by targeted, nonviral delivery of small interfering RNA inhibits tumor growth in a murine model of metastatic Ewing’s sarcoma. Cancer Res. 65 (19), 8984-8992 (2005).
- Schiffelers, R. M., et al. Cancer siRNA therapy by tumor selective delivery with ligand-targeted sterically stabilized nanoparticle. Nucleic Acids Res. 32 (19), 149 (2004).
- Yang, X. Z., et al. Systemic delivery of siRNA with cationic lipid assisted PEG-PLA nanoparticles for cancer therapy. J Control Release. 156 (2), 203-211 (2011).
- Ko, Y. T., Hartner, W. C., Kale, A., Torchilin, V. P. Gene delivery into ischemic myocardium by double-targeted lipoplexes with anti-myosin antibody and TAT peptide. Gene Ther. 16 (1), 52-59 (2009).
- Liu, J., et al. Functionalized dendrimer-based delivery of angiotensin type 1 receptor siRNA for preserving cardiac function following infarction. Biomaterials. 34 (14), 3729-3736 (2013).
- Nam, H. Y., Kim, J., Kim, S. W., Bull, D. A. Cell targeting peptide conjugation to siRNA polyplexes for effective gene silencing in cardiomyocytes. Mol Pharm. 9 (5), 1302-1309 (2012).
- Nam, H. Y., McGinn, A., Kim, P. H., Kim, S. W., Bull, D. A. Primary cardiomyocyte-targeted bioreducible polymer for efficient gene delivery to the myocardium. Biomaterials. 31 (31), 8081-8087 (2010).
- Won, Y. W., McGinn, A. N., Lee, M., Bull, D. A., Kim, S. W. Targeted gene delivery to ischemic myocardium by homing peptide-guided polymeric carrier. Mol Pharm. 10 (1), 378-385 (2013).
- Diao, J., et al. PEG-PLA nanoparticles facilitate siRNA knockdown in adult zebrafish heart. Dev Biol. 406 (2), 196-202 (2015).
- Xiao, C., et al. Chromatin-remodelling factor Brg1 regulates myocardial proliferation and regeneration in zebrafish. Nat Commun. 7, 13787 (2016).
- Wang, F., et al. A Neutralized Noncharged Polyethylenimine-Based System for Efficient Delivery of siRNA into Heart without Toxicity. ACS Appl Mater Interfaces. 8 (49), 33529-33538 (2016).
- Kikuchi, K., et al. Retinoic acid production by endocardium and epicardium is an injury response essential for zebrafish heart regeneration. Dev Cell. 20 (3), 397-404 (2011).
- Hoshijima, K., Jurynec, M. J., Grunwald, D. J. Precise Editing of the Zebrafish Genome Made Simple and Efficient. Dev Cell. 36 (6), 654-667 (2016).
- Zu, Y., et al. TALEN-mediated precise genome modification by homologous recombination in zebrafish. Nat Methods. 10 (4), 329-331 (2013).
- Kesharwani, P., Gajbhiye, V., Jain, N. K. A review of nanocarriers for the delivery of small interfering RNA. Biomaterials. 33 (29), 7138-7150 (2012).
- Luong, D., et al. PEGylated PAMAM dendrimers: Enhancing efficacy and mitigating toxicity for effective anticancer drug and gene delivery. Acta Biomater. 43, 14-29 (2016).
- Luo, K., He, B., Wu, Y., Shen, Y., Gu, Z. Functional and biodegradable dendritic macromolecules with controlled architectures as nontoxic and efficient nanoscale gene vectors. Biotechnol Adv. 32 (4), 818-830 (2014).
- Shcharbin, D., Shakhbazau, A., Bryszewska, M. Poly(amidoamine) dendrimer complexes as a platform for gene delivery. Expert Opin Drug Deliv. 10 (12), 1687-1698 (2013).
