Det er fortsatt en stor utfordring å utvikle betinget gen-knockout eller effektiv gen-knockdown i voksen sebrafisk organer. Her kan vi rapportere en protokoll for utøvende hydrogenion-mediert siRNA gen-stanse i voksen sebrafisk hjerte, noe som gir en ny tap-av-funksjonen metoden for å studere voksen organer i sebrafisk og andre modellen organismer.
Pattedyr har en svært begrenset evne til å regenerere hjertet etter hjerteinfarkt. Derimot, regenererer voksen sebrafisk hjertet sitt etter apex resection eller cryoinjury, gjør det en viktig modell organisme for hjertet gjenfødelse studier. Men har mangel på tap av funksjon metoder for voksen organer begrenset innsikt i mekanismene bak hjertet gjenfødelse. RNA-interferens via forskjellige leveringssystemer er et kraftig verktøy for å stanse gener i pattedyrceller og modell organismer. Vi har tidligere rapportert at siRNA-innkapslet nanopartikler kunne angi celler og resultere i en bemerkelsesverdig gen-spesifikke knockdown i regenererende voksen sebrafisk hjertet. Her presenterer vi en enkel, rask og effektiv protokoll for dendrimer-mediert siRNA levering og slå av genet i regenererende voksen sebrafisk hjertet. Denne metoden gir en alternativ tilnærming for å bestemme genet funksjoner i voksen organer i sebrafisk og kan utvides til andre modellen organismer også.
Hjerteinfarkt er blitt en stor helserisiko, fører til en enorm økonomisk byrde rundt verden1. Voksen pattedyr hjertet ikke klarer å regenerere og fylle det tapte cardiomyocytes på makroskopisk skala etter skaden, fører til dannelse av arr vev og påfølgende hjertesvikt. I motsetning til pattedyr er sebrafisk dugelig av hjertet gjenfødelse, primært gjennom robust hjerteinfarkt spredning etter forskjellige typer hjertet skade, noe som gjør det til en ideell modell organisme for å undersøke molekylære mekanismer av hjertet gjenfødelse 2,3,4,5,6,7,8. Tyde endogene mekanismer er underliggende sebrafisk hjertet regenereringen et spennende område av forskning i jakten på romanen strategier forbedre hjerte gjenfødelse9.
Genetisk manipulasjon metoder er tilgjengelige i sebrafisk. Dette består av morpholinos (MO) som er også mye brukt i frosker, kylling og pattedyr foruten i sebrafisk10,11,12,13. MO har effektiv knockdown av målet genuttrykk i voksen sebrafisk fin, hjernen og netthinnen14,15,16,17,18,19. Låst-nukleinsyre acid (LNA) er en kunstig oligonucleotide brukes til å slå ned endogene genuttrykk ikke bare i sebrafisk embryoer, men også i voksen dyr organer20,21,22, 23 , 24. mangel på effektive tap-av-funksjon metoder for voksnes hjerter er imidlertid en hindring i å studere molekylære mekanismer av organ gjenfødelse. Stede, små-molekylet hemmere eller transgene uttrykk for dominerende-negativ mutanter brukes primært til å blokkere funksjonen til et bestemt gen eller sti å studere dens funksjon i voksen sebrafisk hjertet gjenfødelse25,26 ,27. Men ikke alle gener eller signalveier gjelder for disse metodene.
Små-konflikt RNAs (siRNAs) brukes for tap av funksjon analyse i pattedyrceller og embryo modell organismer, i tillegg til voksen organer for prekliniske studier i dyr modeller28,29,30 , 31 , 32. siRNAs har blitt effektivt brukt til taushet gener i svulster33,34,35 og cardiomyocytes36,37,38,39 ,40 via forskjellige leveringssystemer. Nylig har utviklet vi effektive siRNA-innkapslet hydrogenion gen-stanse i regenererende voksen hjertet med flere forskjellige nanopartikler41,42,43, gir et romanen verktøy for funksjonell studier av gener i voksen sebrafisk organer. Basert på våre tidligere studier41,42,43, presenterer her vi en enkel, praktisk, men kraftig protokoll for siRNA gen-stanse i regenererende voksen sebrafisk hjertet bruke f-PAMAM-PEG-R9 dendrimers. Aldh1a2 (aldehyd dehydrogenase 1 familie, medlem A2) genet ble upregulated etter sebrafisk apex eksisjon og ablasjon av Aldh1a2 blokkert cardiac gjenfødelse44. Her tar vi aldh1a2 genet som et eksempel å teste genet knockdown effektiviteten formidlet av hydrogenion-kapslet siRNA injeksjon. Denne protokollen inneholder en fremgangsmåte for sebrafisk hjertet resection, syntese av nanopartikler og en leveringsmetode på siRNA-innkapslet nanopartikler inn voksen sebrafisk hjertet.
Sebrafisk er fullt i stand til å regenerere forskjellige organer inkludert voksen hjertet5. Mens transgene og genetiske metoder er godt utviklet for å studere genet funksjoner i fosteret av sebrafisk, står etterforskere fortsatt overfor uoverkommelige generere betinget mutant alleler i sebrafisk45,46. Dermed transgene dominerende-negativ mutanter eller små molekyl hemmere brukes ofte til adressen genet funksjoner i voksen sebrafisk org…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takker Dr. IC Bruce for kritiske kommentarer og lese manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra National Natural Science Foundation i Kina (31430059, 31701272, 31730061, 81470399 og 31521062), AstraZeneca Asia, og fremvoksende markedet Innovative medisin og tidlig utvikling.
tricaine | Sigma | E10521 | Store at 4°C |
stereomicroscope | Leica | S8AP0 | |
sharp forcep | WPI | 14098 | |
iridectomy scissors | WPI | 501778 | |
elbow tweezers | Suzhou Liuliu | SE05Cr | |
α,ω-dipyridyl disulfido polyethylene glycol(Py-PEG-Py) | Biomatrik (Jiaxing) Inc. | 5239 | |
core of G4.0 polyamidoamine (PAMAM) | Andrews ChemServices | AuCS-297 | |
vacuum drying equipment | Yiheng | DZF-6020 | |
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Gibco | 14190144 | |
tris(2-carboxyethyl)phosphine(TCEP) | Alfar Aesar | 51805-45-9 | Causes severe skin burns and eye damage. Causes serious eye damage. |
ultrafiltration tube | Millipore | UFC900308 | |
freeze dryer | Martin Christ | Alpha 2-4 Ldplus | |
NMR spectrometer | Bruker | AV400 | |
Deuterium oxide(D2O) | J&K | 174611 | |
NMR sample tube | J&K | WG-1000-7-50 | |
3 kDa MWCO ultrafiltration tube | Merck | UFC900308 | |
sea salts | Instant Ocean® | SS15-10 |