Identification et isolement des Oligopotent et des progéniteurs myéloïdes Lineage-commis de moelle osseuse de souris
Summary
Nous démontrons comment identifier et isoler les 6 sous-ensembles de progéniteurs myéloïdes de murins de la moelle osseuse à l’aide d’une combinaison de magnétique et de la fluorescence de tri (MACS et FACS). Ce protocole peut être utilisé pour les essais de culture in vitro (cultures de méthylcellulose ou liquide), des expériences in vivo transfert adoptif et analyses ARN/protéines.
Abstract
Les progéniteurs myéloïdes qui donnent les neutrophiles, les monocytes et les cellules dendritiques (CD) peuvent être identifiés en et isolées de la moelle osseuse de souris pour les analyses hématologiques et immunologiques. Par exemple, les études sur les propriétés moléculaires et cellulaires des populations progéniteur myéloïde peuvent révéler les mécanismes sous-jacents de transformation leucémique, ou démontrer comment le système immunitaire réagit à l’exposition de l’agent pathogène. Auparavant les stratégies cytométrie en flux décrits pour l’identification des progéniteurs myéloïdes ont permis des avancées significatives dans de nombreux domaines, mais les fractions qu’ils identifient sont très hétérogènes. Les stratégies de blocage plus couramment utilisés définissent des fractions de la moelle osseuse qui sont enrichies pour les populations souhaitées, mais contiennent également un grand nombre de progéniteurs « contaminer ». Nos études récentes ont résolu une grande partie de cette hétérogénéité et le protocole que nous présentons ici permet l’isolement des 6 sous-populations d’oligopotent et progéniteurs myéloïdes lineage-commis de 2 décrit précédemment les fractions de la moelle osseuse. Le protocole décrit 3 stades : des cellules d’isolement 1) de la moelle osseuse, 2) enrichissement de progéniteurs hématopoïétiques par cellule magnétique activé tri (appauvrissement de la lignée de MACS) et 3) identification de sous-ensembles progéniteur myéloïde par cytométrie en flux (y compris fluorescence-lancée de cellules tri, FACS, si vous le souhaitez). Cette approche permet la quantification de l’ancêtre et l’isolement pour une variété d’applications in vitro et in vivo et a déjà donné lieu à nouveau aperçu de voies et les mécanismes des neutrophiles, monocytes et différenciation de DC.
Introduction
Monocytes, les neutrophiles et les cellules dendritiques (CD) sont des cellules myéloïdes qui découlent des progéniteurs hématopoïétiques, principalement dans la moelle osseuse, par un processus appelé myelopoiesis. Progéniteurs myéloïdes communs (CMPs) sont susceptibles de produire des cellules myéloïdes, ainsi que mégacaryocytes et les érythrocytes, mais les cellules lymphoïdes pas. Progéniteurs de granulocyte-monocyte (BPF), qui sont dérivées du CMPs, produisent des granulocytes et des monocytes, mais ont perdu mégacaryocyte et érythrocytaire potentiel. Monocytes et classique et plasmacytoides DCs (CDC/PDC) semblent également découler de progéniteurs communs appelées progéniteurs de monocyte-DC (AMD), qui sont produites par le CMPs. graduel restriction du potentiel de la lignée aboutit à lineage-commis cellules souches : progéniteurs de granulocyte, progéniteurs des monocytes et progéniteurs des cellules dendritiques (Figure 1).
Weissman et ses collaborateurs ont que CMPs sont retrouvent dans le Lin– c-Kit+ Sca-1– CD34 (LKS–)+ FcγRlo fraction de moelle osseuse de souris, les BPF est exposées dans le CD34 LKS– + FcγR Salut fraction1. Toutefois, ces fractions « CMP » et « GMP » sont très hétérogènes. Par exemple, la fraction « GMP » contient également des progéniteurs de la lignée-commis de granulocytes et les monocytes progéniteurs1,2. Les AMD auraient séparément CX3CR1+ Flt3+ CD115+ progéniteurs qui expriment également CD34 et FcγR3,4. Les AMD donnent lieu à cDC/pDC-production commune DC progéniteurs (CDP), qui ont été signalés à exprimer des niveaux inférieurs de c-Kit (CD117) et ne sont pas inclus dans la fraction LKS– 5.
On pensait auparavant que les monocytes se posent via une voie unique (COP/MOP-GMP-MDP-monocyte). Compatible avec ce modèle, monocyte-commis progéniteurs produites par les bonnes pratiques de fabrication (nommé progéniteurs de monocyte, MPs)2 et les AMD (nommés progéniteurs communs de monocyte, cMoPs)6 semblent être les mêmes cellules sur la base de l’expression du marqueur de surface partagée . Cependant, nous avons récemment démontré que les monocytes sont produites indépendamment par PRIG et AMD et étaient capables de distinguer entre les députés et cMoPs unicellulaires RNA séquençage7.
Nous avons récemment modifié la Weissman « CMP » et la stratégie de blocage « GMP » afin d’identifier 6 sous-fractions de moelle osseuse de souris C57BL/6J contenant différent oligopotent et sous-ensembles progéniteur myéloïde lineage-commis. Nous avons pour la première fois que la coloration pour Ly6C et CD115 permet l’isolement des oligopotent PRIG, ainsi que des progéniteurs de granulocytes (GPs) et des progéniteurs de monocyte (MPs et cMoPs, qui nous est actuellement impossible de séparer) de la fraction « GMP »2 (LKS – CD34+ FcγRSalut porte ; La figure 1). Par la suite, nous avons démontré que les AMD se trouvent principalement dans la fraction « CMP » (CD34 LKS– + FcγRlo gate), qui contient aussi Flt3+ CD115lo et Flt3– sous-ensembles7 (Figure 1 ). Le CMP-Flt3+ CD115lo fraction donne les BPF et les AMD sur transfert adoptif. Le sous-ensemble de CMP-Flt3– contient des progéniteurs qui semblent être des intermédiaires entre les cellules de CMP-Flt3+ CD115lo et BPF. Contrairement aux AMD, le CMP-Flt3+ CD115lo et COP/MOP-Flt3– fractions possèdent également mégacaryocyte et érythrocytaire potentiel.
Il est important de noter, toutefois, que l’on ignore actuellement si les fractions « CMP » contiennent des cellules souches qui sont vraiment oligopotent (par exemple, les cellules individuelles au sein de la COP/MOP-Flt3+ CD115lo fraction qui possèdent des neutrophiles, monocytes, DC, mégacaryocyte et érythrocytaire potentiel), ou alternativement, constituent un mélange de géniteurs ayant un potentiel de lignée plus restreint. Colonie formant des dosages (cultures de méthylcellulose) a révélé des cellules avec des granulocytes (neutrophiles), érythrocytes, monocyte et mégacaryocyte potentiel (cellules GEMM) dans le « CMP », CMP-Flt3+ CD115lo et fractions de CMP-Flt3– 1 ,7, mais ne permettent pas l’évaluation du potentiel de DC. En revanche, formant des dosages des colonies a démontré l’existence d’oligopotent BPF (progéniteurs neutrophile et monocytes potentiels) dans le « GMP » fraction1,2, et cela est pris en charge par ces dernières monocellulaires d’analyse transcriptomique8. Il n’est pas actuellement connu, cependant, si ces BPF oligopotent produire aussi d’autres granulocytes (éosinophiles, basophiles et mastocytes).
Après ces études, nous démontrons maintenant comment 7 surface marqueurs (c-Kit, Sca-1, CD34, FcγR, Flt3, Ly6C et CD115) peut être utilisé pour identifier et isoler les 6 sous-ensembles d’oligopotent et commis à la lignée des progéniteurs myéloïdes. Le protocole décrit ici peut être appliqué pour les essais de culture in vitro (cultures de méthylcellulose ou liquide), expériences de transfert adoptif in vivo chez la souris et l’analyse moléculaire (séquençage de RNA en vrac et unicellulaires, Western Blot, etc.).
Le protocole se compose de 3 étapes : 1) préparation d’une suspension de cellule de la moelle osseuse des cellules, 2) programme d’enrichissement des progéniteurs hématopoïétiques (tri cellulaire magnétique activé) et 3) identification et isolement si vous le souhaitez, de sous-ensembles de progéniteurs de flux cytométrie en flux (en utilisant un analyseur ou un trieur, selon le cas). La première étape est l’isolement des cellules de moelle osseuse des fémurs et tibias de souris euthanasiés et ressemble aux autres protocoles décrits antérieurement9. Ensuite, l’échantillon est enrichi pour des cellules souches et progénitrices utilisant un cocktail d’anticorps dirigés contre des marqueurs de surface cellulaire des érythrocytes, polynucléaires neutrophiles, monocytes, lymphocytes, etc., pour épuiser les cellules différenciées. Ce n’est pas obligatoire, mais fortement recommandé pour optimiser la détection des sous-ensembles progénitrices et de réduire la quantité d’anticorps nécessaires à l’identification de l’ancêtre et le temps requis pour la cytométrie en flux. Le protocole de l’appauvrissement de lignage ci-dessous décrit Magnetic-Activated cellule Tri (MACS) en utilisant un Kit souris lignée cellulaire épuisement (qui contient les anticorps biotinylés contre CD5, CD45R (B220), CD11b, Gr-1 (Ly6G/C), 7-4 et Ter-119, plus anti-biotine microbilles) et un séparateur magnétique automatisé. L’étape finale consiste à déterminer (et le tri, si vous le souhaitez) des sous-ensembles progénitrices par cytométrie en flux. Le panel d’anticorps décrits ci-dessous (voir également tableau 1) a été conçu pour être utilisé dans un cytomètre en flux (analyseur ou trieur) avec les 4 lasers (405 nm, 488 nm, 561 nm, 640 nm).
Figure 1 : progéniteurs DC, les monocytes et les neutrophiles et les voies de différenciation. Le modèle récemment révisé de myelopoiesis7 est illustré, avec les portes de Weissman pour « CMPs » (bleus) et les « Bonnes pratiques de fabrication » (vert)1 superposées. Ce chiffre a été modifié par Yáñez al 20177. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Protocol
Representative Results
Discussion
La Weissman gating stratégie pour souris progéniteur myéloïde identification1 a été l’étalon-or pour les immunologistes et hématologues depuis près de 20 ans, mais il semble maintenant que les portes « CMP » et « GMP » sont très hétérogènes et plus précis stratégies de blocage sont nécessaires. Le protocole que nous avons décrite ici permet l’identification d’oligopotent et de sous-ensembles de lignée-commis chez les souris C57BL/6J pour une quantification plus pré…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce protocole a été développé à l’aide de fonds du Conseil de gouverneurs Regenerative Medicine Institut au Cedars-Sinai Medical Center (HSG), une carrière à bourse d’immunologie de l’Association américaine des immunologistes (à AY et HSG) et une bourse de chercheur de l’American Society of Hematology (à AY). Nous remercions le Flow Cytometry Core au Cedars-Sinai Medical Center d’assistance avec le tri des FACS.
Materials
| Mouse: Wild-type C57BL/6J (CD45.2) | The Jackson Laboratories | Cat#JAX:000664 | |
| Lineage Cell Depletion Kit, mouse | Miltenyi Biotec | Cat#130-090-858 | |
| Rat anti-mouse CD34 (clone RAM34) FITC | BD Biosciences | Cat#553733 | |
| Rat anti-mouse CD16/CD32 (FcγR; clone 93) APC-Cy7 | BioLegend | Cat#101327 | |
| Rat anti-mouse Ly6A/E (Sca-1; clone 108113) PE-Cy7 | BioLegend | Cat#108114 | |
| Rat anti-mouse CD117 (c-Kit; clone 2B8) Pacific Blue | BioLegend | Cat#105820 | |
| Rat anti-mouse Ly6C (clone HK1.4) PerCP-Cy5.5 | BioLegend | Cat#128012 | |
| Rat anti-mouse CD115 (clone AFS98) PE | BioLegend | Cat#135506 | |
| Rat anti-mouse CD135 (Flt3; clone A2F10.1) APC | BD Biosciences | Cat#560718 | |
| CountBright Absolute Counting Beads | Thermo Fisher Scientific | Cat#C36950 | |
| AutoMACS Separator | Miltenyi Biotec | N/A | Use the "deplete" program |
| BD LSRFortessa | BD Biosciences | N/A | 5 lasers, 15 colors |
| BD FACS Aria III cell sorter | BD Biosciences | N/A | 5 lasers, 13 colors |
| FlowJo | FlowJo, LLC | https://www.flowjo.com | For further analysis of the .fcs files |
References
- Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages. Nature. 404 (6774), 193-197 (2000).
- Yáñez, A., Ng, M. Y., Hassanzadeh-Kiabi, N., Goodridge, H. S. IRF8 acts in lineage-committed rather than oligopotent progenitors to control neutrophil vs monocyte production. Blood. 125 (9), 1452-1459 (2015).
- Auffray, C., et al. CX3CR1+ CD115+ CD135+ common macrophage/DC precursors and the role of CX3CR1 in their response to inflammation. Journal of Experimental Medicine. 206 (3), 595-606 (2009).
- Fogg, D. K., et al. A clonogenic bone marrow progenitor specific for macrophages and dendritic cells. Science. 311 (5757), 83-87 (2006).
- Onai, N., et al. Identification of clonogenic common Flt3+M-CSFR+ plasmacytoid and conventional dendritic cell progenitors in mouse bone marrow. Nature Immunology. 8 (11), 1207-1216 (2007).
- Hettinger, J., et al. Origin of monocytes and macrophages in a committed progenitor. Nature Immunology. 14 (8), 821-830 (2013).
- Yáñez, A., et al. Granulocyte-monocyte progenitors and monocyte-dendritic cell progenitors independently produce functionally distinct monocytes. Immunity. 47 (5), 890-902 (2017).
- Olsson, A., et al. Single-cell analysis of mixed-lineage states leading to a binary cell fate choice. Nature. 537 (7622), 698-702 (2016).
- Amend, S. R., Valkenburg, K. C., Pienta, K. J. Murine hind limb long bone dissection and bone marrow isolation. Journal of Visualized Experiments. (110), (2016).
- Yáñez, A., Goodridge, H. S. Interferon regulatory factor 8 and the regulation of neutrophil, monocyte, and dendritic cell production. Current Opinion in Hematology. 23 (1), 11-17 (2016).
- Manz, M. G., Miyamoto, T., Akashi, K., Weissman, I. L. Prospective isolation of human clonogenic common myeloid progenitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (18), 11872-11877 (2002).
