Isolierung und Identifizierung von Extravascular Immunzellen des Herzens
Summary
Dieses Protokoll stellt eine einfache und effiziente Methode, um zu isolieren, Identifikation und Quantifizierung von Immunzellen, die ihren Wohnsitz im Myokard von Mäusen im Steady-State oder Entzündungen. Das Protokoll kombiniert mechanische und enzymatische Verdauung zur Erzeugung einer einzelnen Zelle Suspension, die weiter durch Durchflusszytometrie analysiert werden können.
Abstract
Das Immunsystem ist ein wesentlicher Bestandteil eines gesunden Herzens. Der Herzmuskel ist Heimat einer reichen Bevölkerung von verschiedenen Immunzellen Teilmengen mit funktionaler Aufteilung bei Steady-State und bei verschiedenen Formen von Entzündungen. Bis vor kurzem das Studium der Immunzellen im Herzen erforderte den Einsatz der Mikroskopie oder schlecht entwickelte Verdauung Protokolle, genügend Sensibilität während einer schweren Entzündung aber konnten nicht sicher identifizieren kleine-aber wichtige-Populationen von Zellen im Steady-State. Hier diskutieren wir eine einfache Methode kombinieren enzymatische (Kollagenase, Hyaluronidase und DNAse) und mechanische Verdauung der murinen Herzen vorangestellt intravaskulärer Verabreichung von eindringmittel radioaktiv markierten Antikörper gegen kleine unterscheiden aber unvermeidbar intravaskulären Zelle Verunreinigungen. Diese Methode erzeugt eine Aussetzung der isolierten lebensfähige Zellen, die durch Durchflusszytometrie zur Identifikation, Phänotypisierung und Quantifizierung analysiert oder weiter gereinigt mit Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung oder magnetischer Wulst Trennung für werden können transkriptionelle Analyse oder in-vitro- Studien. Wir sind ein Beispiel für eine schrittweise durchflusszytometrischen Analyse der wichtigsten Makrophagen und dendritischen Zellpopulationen des Herzens zu unterscheiden. Für eine mittlere Größe Experiment (10 Herzen) erfordert der Abschluss des Verfahrens 2 – 3 h.
Introduction
Verschiedene Formen der myokardialen Stress oder Verletzungen, einschließlich ischämische (Ischämie Reperfusion oder Myokardinfarkt) und nicht-ischämische (Hypertonie oder Myokarditis), fördern die Einstellung von Entzündungszellen mit reparative und schützend, sondern auch pathogenen Eigenschaften. Bereits im Jahr 1891, beschrieben Romberg erstmals das Vorhandensein von zellulären Infiltrate im Herzmuskel von Patienten mit Typhus und Scharlach1. Jedoch erforderlich der Detailstudie des kardialen Immunzellen die Entwicklung von fortgeschrittenen Immunphänotypisierung Techniken. Infolgedessen haben wir erst vor kurzem begonnen zu verstehen, dass eine vielfältige Bevölkerung von Immunzellen mit notwendigen Wartungs-Rollen während der Steady-State innerhalb der Herzmuskel befindet.
Histologie wurde und immer noch ist, die am häufigsten verwendete Methode, kardiale Immunzellen während einer Entzündung zu charakterisieren. Während Histologie ein wertvolles diagnostisches Instrument darstellt, hat seine Verwendung in der Studie von kardialen Immunzellen jedoch wichtige Einschränkungen. Die Immunzellen mit Wohnsitz im Myokard stellen einen sehr kleinen Teil der gesamten Zellen und sind mehr oder weniger gleichmäßig verteilt in einem verhältnismäßig großen Raum. Ähnlich, zeigen verschiedene Formen der kardialen Entzündung, wie virale Myokarditis, fokale Muster der Entzündung. Dies bedeutet, dass die genaue Analyse des Immunsystems des Herzens erfordern oft höhere Grade der histologischen Probenahme, Erhöhung der Kosten um Verzerrungen zu reduzieren. Darüber hinaus bietet die Histologie eine sehr begrenzte Menge von brauchbaren Informationen in Zelle Identifikation (z.B. Anzahl der Parameter). Mit einer ständig wachsenden Zahl der Zelle Teilmengen, die mehrere Ausdruck Marker (einschließlich oberflächenmarker, Transkriptionsfaktoren oder abgesondert Moleküle) erfordert, hat sich Durchflusszytometrie als das mächtigste Werkzeug für die Immunphänotypisierung etabliert, aufgrund der Low-Cost und hohem Durchsatz.
Die Immunphänotypisierung Techniken richtet sich eng an der Entwicklung von effizienten Verdauung-Protokolle, die für einzelne Zellen Analyse einer großen Anzahl von Zellen erlaubt. Die Entwicklung der ausführliche Protokolle der Zelle Extraktion eröffnet ein neues Fenster der Möglichkeiten in der Studie von kardialen Immunologie. Durch die Kombination von Verdauung, Durchflusszytometrie und Transkriptom wurden die großen Populationen von Makrophagen und dendritischen Zellen, die ihren Wohnsitz im Herzen zeichnet sich2,3. Die am häufigsten vorkommende Bevölkerung von kardialen Immunzellen im Steady-State sind CD64++ MerTK Makrophagen, die weiter unterteilt werden können, basierend auf ihren Ausdruck CCR2 oder CD11c2. CCR2+ Makrophagen stammen aus Erwachsenen Knochenmark Hämatopoese, während die Mehrheit des CCR2– Makrophagen, die hohe oder niedrige Niveaus des MHC-II zum Ausdruck bringen können, sind vor allem pränatalen Ursprungs. Makrophagen führen Sie wichtige Funktionen wie Reparatur4 und Entfernung von Schmutz5 bei Verletzungen oder elektrische Verbindungstechnik6 im Steady-State zu unterstützen. Während verschiedene Formen von Entzündungen ein wichtige Zustrom von Ly6CHallo MHC-IIlo CD64Int Monozyten auftreten, zu unterscheiden, die später in Ly6CHallo CCR2+ Makrophagen2,7 . Eine deutlich kleinere, aber wichtige Population von Zellen, die ihren Wohnsitz im Myokard von gesunden Personen besteht aus dendritischen Zellen8,9. Die zwei großen Teilmengen von kardialen herkömmlichen DCs (cDCs) wurden vor kurzem charakterisiert: cDC1 (CD103+ DCs) und cDC2 (CD11b+ DCs). DCs eine wichtige Rolle in der Verteidigung gegen Infektion8 aber auch Selbstverletzung während einer Entzündung, besonders bei Myokardinfarkt9fördern können.
Hier beschreiben wir eine einfache Methode zur Isolierung von lebensfähigen kardiale Immunzellen aus Maus Myokard. Die Methode kombiniert mechanische und enzymatische Verdauung mit Zelle-Sieb Filtration um eine einzelne Zelle Suspension zu erhalten, die analysiert oder durch Flow Cytometry sortieren oder magnetischer Wulst Bereicherung weiter gereinigt werden können. Genaue Messungen der extravascular Herzmuskelzellen erfordern kardialen Durchblutung um mögliche Verunreinigungen aus dem Blutkreislauf der kardiologische Microvasculature zu entfernen. Darüber hinaus präsentieren wir Ihnen einen optionalen Schritt des intravaskulären Kennzeichnung von Immunzellen, die verwendet werden, um weitere Herzmuskelzellen intravaskulären Verunreinigungen, basierend auf der Galkina Et Al. Protokoll10unterscheiden. Schließlich präsentieren wir eine grundlegende Flow Cytometry Analyse Ermittlung die wichtigsten Subpopulationen von Makrophagen und cDC.
Protocol
Representative Results
Discussion
Myokardiale Entzündung oder Herzmuskelentzündung (Myokarditis), ist ein Merkmal der meisten Herz-Kreislauf-Krankheiten. Der Herzmuskel ist jedoch nicht frei von eigener immun Komponenten in Krankheitszuständen. Im Steady-State viele Immunzellen befinden sich im Myokard und spielen die wesentliche Rolle der Wartung und Schutz. Die Charakterisierung dieser vielfältigen Populationen von Zellen wäre nicht möglich ohne Methoden wie dem präsentiert in diesem Protokoll gewesen.
Eine Kombinatio…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde unterstützt durch die Canadian Institutes of Health Research (148808 und 148792), SE wurde unterstützt durch ein Herz und Stroke Foundation, Personal Award vom Ontario Provincial Office, March of Dimes, Ted Rogers Centre for Heart Research und Peter Munk Herz Zentrum. XCC hält eine CIHR Banting Fellowship. LA hält ein Herz & Schlaganfall/Richard Lewar Zugehörigkeit Award.
Materials
| Phosphate buffered saline | Wisent | 311-010-CL | 1x PBS |
| 21Gx 1 1/2 (0.8mmx40mm) PrecisionGlide Needle | BD | 305167 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Wisent | 311-511-CL | 1x HBSS |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A4503-50G | |
| Bovine serum | Sigma | B9433 | |
| 0.5M Ethylenediaminetetraacetic acid | BioShop | EDT111 | |
| Vacuum filter , 0.2 µm Filtropur V50 | Sarstedt | 83.1823.001 | |
| 28G 1/2 1 cc insulin syringe | BD | 329424 | |
| 60 mL syringe | BD | 309653 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Wisent | 319-005-CL | 1x DMEM with 4.5 g/L glucose and L-Glutamine and Sodium Pyruvate |
| Collagenase I | Sigma | C0130 | from Clostridium histolyticum |
| Hyaluronidase type I-S | Sigma | H3506 | |
| DNase-I | Sigma | D4513 | from bovine pancreas |
| Cell strainer, 40 µm Nylon | Falcon | 352340 | |
| Ammonium-Chloride- Potassium (ACK) lysis buffer | Lonza | 10-546E | |
| Alexa Fluor 700 anti-mouse/human CD11b | Biolegend | 101222 | 1:250 dilution |
| APC/Cy7 anti-mouse Ly-6c | Biolegend | 128025 | 1:250 dilution |
| APC anti-mouse CD103 | Biolegend | 121414 | 1:250 dilution |
| Brilliant Violet 605 anti-mouse CD11c | Biolegend | 117334 | 1:250 dilution |
| PE anti-mouse Ly-6G | Biolegend | 127607 | 1:250 dilution |
| Pacific Blue anti-mouse I-Ab | Biolegend | 116422 | 1:250 dilution |
| FITC anti-mouse CD64 (FcgRI) | Biolegend | 139315 | 1:250 dilution |
| PE/Cy7 anti-mouse CD45 | Biolegend | 103113 | 1:250 dilution |
| PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD45 | Biolegend | 103132 | 1:40 dilution |
| TruStain fcX (anti-mouse CD16/32) | Biolegend | 101320 | 1:100 dilution |
| True-Stain Monocyte Blocker | Biolegend | 426101 | 1:20 dilution |
| FlowJo V10 | TreeStar Inc | https://www.flowjo.com/solutions/flowjo | |
| Mouse: Batf3-/- | The Jackson Laboratory | JAX: 013755 |
References
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