Aislamiento e identificación de las células inmunes Extravascular del corazón
Summary
Este protocolo presenta un método sencillo y eficaz para aislar, identificar y cuantificar las células inmunes que reside en el miocardio de ratones durante el estado estacionario o inflamación. El protocolo combina la digestión enzimática y mecánica para la generación de una suspensión unicelular que puede ser más analizada por citometría de flujo.
Abstract
El sistema inmune es un componente esencial de un corazón sano. El miocardio es hogar de una rica población de subconjuntos diferentes de célula inmune con compartimentación funcional durante el estado estacionario y durante diferentes formas de la inflamación. Hasta hace poco, el estudio de las células inmunes en el corazón requiere el uso de la microscopía o protocolos de digestión mal desarrollados, que proporcionaron suficiente sensibilidad durante la inflamación severa pero no pudieron con confianza identifican pequeños — pero clave — las poblaciones de células durante el estado estacionario. Aquí, discutimos una combinación simple método enzimático (colagenasa, hialuronidasa y ADNasa) y digestión mecánica de corazones murino precedido por la administración intravascular de anticuerpos fluorescente etiquetado para diferenciar pequeños pero inevitable contaminantes intravascular de la célula. Este método genera una suspensión de células viables aisladas que pueden ser analizadas por citometría de flujo para identificación, phenotyping y cuantificación, o más purificado con clasificación celular activado por fluorescencia o la separación magnética de grano para transcripcionales estudios análisis o in vitro . Incluimos un ejemplo de un análisis de citometría de flujo de paso a paso para distinguir las poblaciones de células dendríticas del corazón y macrófagos clave. Para un experimento de tamaño medio (10 corazones) la terminación del procedimiento requiere de 2-3 h.
Introduction
Diferentes formas de estrés miocárdico o lesiones, incluyendo isquémico (isquemia reperfusión o infarto de miocardio) y no isquémica (hipertensión o miocarditis), promover el reclutamiento de células inflamatorias con reparadora y protectora, sino también propiedades patógenas. Ya en 1891, Romberg describió por primera vez la presencia de infiltrados celulares en el miocardio de pacientes infectados por el tifus y la fiebre escarlata1. Sin embargo, el estudio detallado de las células inmunes cardiacas requiere el desarrollo de las técnicas más avanzadas de immunophenotyping. En consecuencia, sólo recientemente hemos empezado a entender que una población diversa de células inmunes con papeles de mantenimiento esencial durante el estado estacionario en el miocardio.
La histología ha sido y sigue siendo, el método más común para caracterizar a las células inmunes cardiacas durante la inflamación. Sin embargo, mientras que la histología representa una valiosa herramienta de diagnóstico, su uso en el estudio de las células inmunes cardiacas tiene limitaciones importantes. Las células inmunes que reside en el miocardio representan una proporción muy pequeña de las células totales y son más o menos uniformemente distribuidas en un espacio proporcionalmente enorme. Del mismo modo, varias formas de inflamación cardiaca, como la miocarditis viral, muestran patrones focal de inflamación. Esto significa que un análisis minucioso del sistema inmune del corazón requieren a menudo grados más altos de toma de muestras histológicas, aumentando el costo para reducir el sesgo. Por otra parte, la histología proporciona una cantidad muy limitada de información útil en la identificación de la célula (por ejemplo, el número de parámetros). Con un creciente número de subconjuntos de la célula que requieren la utilización de múltiples marcadores de expresión (incluyendo marcadores de superficie, factores de transcripción o moléculas secretadas), citometría de flujo se ha consolidado como la herramienta más potente para Inmunofenotipificación, debido al bajo costo y alto rendimiento.
El uso de técnicas de immunophenotyping depende estrechamente en el desarrollo de protocolos de digestión eficiente que permitió para el análisis de células individuales de un gran número de células. El desarrollo de exhaustivos protocolos de extracción de la célula abre una nueva ventana de oportunidades en el estudio de la inmunología cardiaca. A través de la combinación de digestión, citometría de flujo y la transcriptómica, las principales poblaciones de macrófagos y células dendríticas que residen en el corazón han sido caracterizados2,3. La población más abundante de las células inmunes cardiacas durante el estado estacionario son CD64++ de MerTK los macrófagos, que pueden dividir más a fondo en su expresión de CCR2 o CD11c2base. CCR2+ macrófagos se originan de la hematopoyesis de la médula ósea adulta, mientras que la mayoría de CCR2 los macrófagos– , que pueden expresar altos o bajos niveles de MHC-II, son principalmente de origen prenatal. Los macrófagos realizan funciones claves como reparación4 y retiro de escombros5 lesiones o apoyando la conectividad eléctrica6 en estado estacionario. Durante diferentes formas de la inflamación se producen una importante afluencia de Ly6CHola MHC-IIlo CD64int monocitos, que más tarde se diferencian en Ly6CHola CCR2+ los macrófagos2,7 . Una población perceptiblemente más pequeña, pero importante, de las células que residen en el miocardio de los individuos sanos se compone de células dendríticas8,9. Los dos subconjuntos principales de DCs convencionales cardiacas (CDC) se han caracterizado recientemente: cDC1 (CD103+ DCs) y cDC2 (CD11b+ DCs). DCs desempeñan papeles importantes en la defensa contra la infección8 pero también pueden promover uno mismo-lesión durante la inflamación, particularmente durante el infarto de miocardio9.
Aquí, describimos un método simple para el aislamiento de las células inmunes cardíacas viables de miocardio de ratón. El método combina la digestión enzimática y mecánica con filtración celular-colador para obtener una suspensión unicelular que puede ser analizada, o más purificada, por clasificación de citometría de flujo o enriquecimiento de grano magnético. Las medidas exactas de células del miocardio extravasculares requieren perfusión cardiaca con el fin de eliminar los posibles contaminantes del torrente sanguíneo de la microcirculación cardiaca. Además, presentamos un paso opcional del etiquetado intravascular de células inmunes que pueden utilizarse para distinguir aún más células del miocardio de contaminantes intravasculares, basados en el Galkina et al protocolo10. Por último, presentamos un análisis de citometría de flujo básico para identificar las principales subpoblaciones de macrófagos y cDC.
Protocol
Representative Results
Discussion
Inflamación miocardio o la miocarditis, es una característica de las enfermedades cardiovasculares más. Sin embargo, el miocardio no está desprovista de sus propios componentes inmunes en Estados no patológicos. Durante el estado estacionario, muchas células inmunes residen en el miocardio y desempeñan las funciones esenciales de mantenimiento y protección. La caracterización de estas diversas poblaciones de células no habría sido posible sin métodos como la que se presenta en el presente Protocolo.
<p cl…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por los institutos canadienses de investigación salud (148808 y 148792), SE contó con un corazón y un movimiento Fundación, premio personal de la Oficina Provincial de Ontario, March of Dimes, Ted Rogers Centre para la investigación del corazón y el Peter Munk Centro cardíaco. XCC tiene una beca de Banting CIHR. LA sostiene un corazón & movimiento/Richard Lewar beca premio.
Materials
| Phosphate buffered saline | Wisent | 311-010-CL | 1x PBS |
| 21Gx 1 1/2 (0.8mmx40mm) PrecisionGlide Needle | BD | 305167 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Wisent | 311-511-CL | 1x HBSS |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A4503-50G | |
| Bovine serum | Sigma | B9433 | |
| 0.5M Ethylenediaminetetraacetic acid | BioShop | EDT111 | |
| Vacuum filter , 0.2 µm Filtropur V50 | Sarstedt | 83.1823.001 | |
| 28G 1/2 1 cc insulin syringe | BD | 329424 | |
| 60 mL syringe | BD | 309653 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Wisent | 319-005-CL | 1x DMEM with 4.5 g/L glucose and L-Glutamine and Sodium Pyruvate |
| Collagenase I | Sigma | C0130 | from Clostridium histolyticum |
| Hyaluronidase type I-S | Sigma | H3506 | |
| DNase-I | Sigma | D4513 | from bovine pancreas |
| Cell strainer, 40 µm Nylon | Falcon | 352340 | |
| Ammonium-Chloride- Potassium (ACK) lysis buffer | Lonza | 10-546E | |
| Alexa Fluor 700 anti-mouse/human CD11b | Biolegend | 101222 | 1:250 dilution |
| APC/Cy7 anti-mouse Ly-6c | Biolegend | 128025 | 1:250 dilution |
| APC anti-mouse CD103 | Biolegend | 121414 | 1:250 dilution |
| Brilliant Violet 605 anti-mouse CD11c | Biolegend | 117334 | 1:250 dilution |
| PE anti-mouse Ly-6G | Biolegend | 127607 | 1:250 dilution |
| Pacific Blue anti-mouse I-Ab | Biolegend | 116422 | 1:250 dilution |
| FITC anti-mouse CD64 (FcgRI) | Biolegend | 139315 | 1:250 dilution |
| PE/Cy7 anti-mouse CD45 | Biolegend | 103113 | 1:250 dilution |
| PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD45 | Biolegend | 103132 | 1:40 dilution |
| TruStain fcX (anti-mouse CD16/32) | Biolegend | 101320 | 1:100 dilution |
| True-Stain Monocyte Blocker | Biolegend | 426101 | 1:20 dilution |
| FlowJo V10 | TreeStar Inc | https://www.flowjo.com/solutions/flowjo | |
| Mouse: Batf3-/- | The Jackson Laboratory | JAX: 013755 |
References
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