Summary

心の血管外免疫細胞の分離と同定

Published: August 23, 2018
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Summary

このプロトコルを分離、識別し、定常状態や炎症の間にマウスの心筋に存在する免疫細胞を定量化するシンプルかつ効率的な手法を提案します。プロトコルは、フローサイトメトリーによるさらに分析することができます単一細胞懸濁液の生成のための酵素的及び機械的消化を組み合わせたものです。

Abstract

免疫システムは、健康な心臓の重要なコンポーネントです。心筋は、定常時および炎症の異なった形態の間に機能区分と異なる免疫細胞サブセットの豊富な人口に家。最近まで、心で免疫細胞の研究に必要な顕微鏡を使用または小さな未発達の消化力のプロトコル、重度の炎症の中に十分な感度を提供が、自信を持ってすることができませんでしたを識別する-キーですが-の人口安定状態でセルです。ここでは、簡便な合成酵素 (コラゲナーゼ、ヒアルロニダーゼや DNAse) と前に小を区別する蛍光標識抗体の血管内投与マウスの心の機械的消化について述べるが、やむを得ない血管内細胞の汚染物質。このメソッドは、識別、表現型解析と定量化、フローサイトメトリーで分析したまたは蛍光活性化細胞ソーティングまたは磁気ビードの分離のために更に精製できる分離の実行可能な細胞の懸濁液を生成します転写の解析または生体外で研究。キーのマクロファージと樹状細胞集団の中心部を区別するためにステップバイ ステップ フローサイトの例が含まれています。中規模実験 (10 心) プロシージャの完了には 2-3 h が必要です。

Introduction

心筋応力または損傷、虚血を含む (虚血再灌流や心筋梗塞) の異なった形態と非虚血性 (高血圧や心筋炎) も修復と保護、炎症細胞の募集を促進します。病原性のプロパティ。1891 年には早くもラコストは最初に発疹チフス、猩紅熱の1に感染した患者の心筋細胞の浸潤の存在を説明しました。ただし、心筋免疫細胞の詳細な研究に必要なより高度な診療技術の開発。その結果、ごく最近我々 は定常状態の間に本質的なメンテナンスの役割を持つ免疫細胞の多様な人口が心筋内に存在することを理解し始めています。

組織されているとまだ、炎症における免疫細胞を特徴付ける最も一般的な方法です。しかし、組織は、貴重な診断ツール、心の免疫細胞の研究での使用で重要な制限があります。心筋に存在する免疫細胞は総細胞の非常に小さい割合を表すし、比例して巨大空間でもっとまたはより少なく均等に分散します。同様に、ウイルス性心筋炎など、心筋の炎症のいくつかのフォームは、炎症の焦点のパターンを示します。つまりは心の免疫システムの正確な分析がしばしば組織学的サンプリング、バイアスを減らすためのコストの増加の高い学位を必要とします。また、組織は、細胞の識別 (例えばパラメーターの数) で使用可能な情報の非常に限られた量を提供します。細胞サブセット (表面マーカー、転写因子分泌分子など) 複数の式マーカーの使用を必要とする数が増え、フローサイトメトリーは、診療の最も強力なツールとして地位を確立して低コスト、高スループット。

診療技術の使用は多数細胞の単一細胞分析のできる効率的な消化力のプロトコルの開発に密接に依存します。細胞抽出の徹底的なプロトコルの開発は、心臓の免疫学の研究で機会の新しいウィンドウを開きます。消化、フローサイトメトリー、トランスクリプトームの組み合わせを介してマクロファージと樹状細胞の中心部に存在する主要な人口は特徴付けられる2,3をされています。安定状態で心臓の免疫細胞の最も豊富な人口が CD64+MerTK+ CCR2 または CD11c2の表現に基づいてさらに分けることができますマクロファージ。CCR2+に対し、マクロファージが成人の骨髄造血に属します大半 CCR2 の MHC-II の高または低のレベルを表現できる、マクロファージが出生前の起源の主に。マクロファージは、修理4傷害または定常状態における電気的接続6のサポート中に破片5の除去など主要な機能を実行します。異なるフォームの炎症の時に Ly6CこんにちはMHC-IIlo CD64int単球の重要な流入発生、これは後に Ly6CこんにちはCCR2 分化+マクロファージ2,7.健常者の心筋に存在する細胞のかなり小さいが重要な人口樹状細胞8,9で構成されます。心臓従来 Dc (cDCs) の 2 つの主要なサブセットが最近特徴付けられる: cDC1 (CD103+ Dc)、cDC2 (CD11b+ Dc)。Dc は感染8に対して防衛で重要な役割を果たすが、促進炎症、心筋梗塞9特に中に自傷をすることも。

ここでは、単純なマウス心筋から心臓免疫細胞の分離法について述べる.メソッドは、分析、または流れの cytometry の並べ替えまたは磁気ビーズ濃縮により更に精製できる単一細胞懸濁液を得るためにセル ストレーナー濾過と酵素的及び機械的消化を組み合わせたものです。管外の心筋細胞の正確な測定は、心臓の血管の血流からの可能な汚染物を除去するために心筋灌流を必要があります。さらに、さらに撮影プロトコル10に基づく血管内の汚染物質から心筋細胞を区別する使用ことができます免疫細胞の血管内ラベリングのオプションの手順を提案する.最後に、主要なマクロファージと cDC のサブポピュレーションを識別するために基本的な流れフローサイトメトリー解析を提案します。

Protocol

倫理ステートメント: このプロトコルがレビューおよび大学健康ネットワーク (トロント、カナダ) で動物ケア委員会によって承認された動物のケアに関するカナダの理事会に準拠して。 1. バッファー準備 HBB バッファー (ハンクのバランスの取れた塩ソリューション (HBSS)、2% の熱不活化ウシ血清、0.2% ウシ血清アルブミン) を準備します。10 mL の熱不活ウシ血清と …

Representative Results

日には、よい方法設計されていますない心筋細胞など、他のコンポーネントの心筋細胞から免疫細胞を分離します。したがって、CD45 続く単一セルおよび小型除外ゲート (図 1A) 免疫細胞群を識別するために、あらかじめゲーティング フローサイトメトリーによる心筋単一細胞懸濁液の分析が必要です。また、死んだ細胞を除外する?…

Discussion

心筋の炎症や心筋炎、最も心血管疾患の機能であります。ただし、心筋はありません非病気の状態で、独自の免疫のコンポーネントを欠いています。定常状態の時に多くの免疫細胞は、心筋に存在し、保守と保護の不可欠な役割を果たします。細胞のこれらの多様な人口の特性はこのプロトコルで発表したものなどの方法なしで可能をでしょう。

心筋の機械的および酵?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この作品は、カナダの協会の健康調査 (148808 148792) によって支えられた、SE に支えられ心臓・卒中財団、オンタリオ地方事務所、10 セントの行進財団、テッド ・ ロジャース センターの心研究 Peter Munk 人材賞」を受賞心臓センター。XCC 機構バンティング交わりを保持します。ラは、心臓と脳卒中/リチャード ・ Lewar 就労賞を保持します。

Materials

Phosphate buffered saline Wisent 311-010-CL 1x PBS
21Gx 1 1/2 (0.8mmx40mm) PrecisionGlide Needle BD 305167
Hank’s Balanced Salt Solution Wisent 311-511-CL 1x HBSS
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A4503-50G
Bovine serum Sigma B9433
0.5M Ethylenediaminetetraacetic acid BioShop EDT111
Vacuum filter , 0.2 µm Filtropur V50 Sarstedt 83.1823.001
28G 1/2 1 cc insulin syringe BD 329424
60 mL syringe BD 309653
Dulbecco's Modified Eagle Medium Wisent 319-005-CL 1x DMEM with 4.5 g/L glucose and L-Glutamine and Sodium Pyruvate
Collagenase I Sigma C0130 from Clostridium histolyticum
Hyaluronidase type I-S Sigma H3506
DNase-I Sigma D4513 from bovine pancreas
Cell strainer, 40 µm Nylon Falcon 352340
Ammonium-Chloride- Potassium (ACK) lysis buffer Lonza 10-546E
Alexa Fluor 700 anti-mouse/human CD11b Biolegend 101222 1:250 dilution
APC/Cy7 anti-mouse Ly-6c Biolegend 128025 1:250 dilution
APC anti-mouse CD103 Biolegend 121414 1:250 dilution
Brilliant Violet 605 anti-mouse CD11c Biolegend 117334 1:250 dilution
PE anti-mouse Ly-6G Biolegend 127607 1:250 dilution
Pacific Blue anti-mouse I-Ab Biolegend 116422 1:250 dilution
FITC anti-mouse CD64 (FcgRI) Biolegend 139315 1:250 dilution
PE/Cy7 anti-mouse CD45 Biolegend 103113 1:250 dilution
PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD45 Biolegend 103132 1:40 dilution
TruStain fcX (anti-mouse CD16/32) Biolegend 101320 1:100 dilution
True-Stain Monocyte Blocker Biolegend 426101 1:20 dilution
FlowJo V10 TreeStar Inc https://www.flowjo.com/solutions/flowjo
Mouse: Batf3-/- The Jackson Laboratory JAX: 013755

References

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Cite This Article
Aronoff, L., Epelman, S., Clemente-Casares, X. Isolation and Identification of Extravascular Immune Cells of the Heart. J. Vis. Exp. (138), e58114, doi:10.3791/58114 (2018).

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