अलगाव और दिल की Extravascular प्रतिरक्षा कोशिकाओं की पहचान
Summary
इस प्रोटोकॉल को अलग करने के लिए एक सरल और कुशल विधि प्रस्तुत करता है, की पहचान और स्थिर राज्य या सूजन के दौरान चूहों के मायोकार्डियम में रहने वाले प्रतिरक्षा कोशिकाओं को बढ़ाता है. प्रोटोकॉल एंजाइमी और यांत्रिक पाचन एक एकल सेल निलंबन है कि आगे प्रवाह cytometry द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है की पीढ़ी के लिए जोड़ती है ।
Abstract
प्रतिरक्षा प्रणाली एक स्वस्थ दिल का एक आवश्यक घटक है । मायोकार्डियम दोनों स्थिर राज्य के दौरान और सूजन के विभिंन रूपों के दौरान कार्यात्मक compartmentalization के साथ अलग प्रतिरक्षा सेल सबसेट के एक अमीर आबादी के लिए घर है । हाल ही में जब तक, दिल में प्रतिरक्षा कोशिकाओं के अध्ययन के उपयोग की आवश्यकता माइक्रोस्कोपी या खराब पाचन प्रोटोकॉल, जो गंभीर सूजन के दौरान पर्याप्त संवेदनशीलता प्रदान की है लेकिन विश्वास करने में असमर्थ थे की पहचान करने के लिए छोटे-लेकिन कुंजी-की आबादी स्थिर अवस्था के दौरान कक्ष । यहां, हम एक सरल एंजाइमी संयोजन विधि चर्चा (collagenase, hyaluronidase और DNAse) और murine दिल के यांत्रिक पाचन फ्लोरोसेंट-बला एंटीबॉडी के intravascular प्रशासन से पहले छोटे लेकिन अपरिहार्य अंतर intravascular कोशिका दूषित होते. इस विधि अलग व्यवहार्य कोशिकाओं है कि पहचान, phenotyping और ठहराव, या आगे प्रतिदीप्ति के साथ शुद्ध-सक्रिय कोशिका छंटाई या चुंबकीय मनका जुदाई के लिए के लिए प्रवाह cytometry द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है की एक निलंबन उत्पंन transcriptional एनालिसिस या इन विट्रो स्टडीज । हम दिल की कुंजी मैक्रोफेज और वृक्ष कोशिका आबादी अंतर करने के लिए एक कदम दर कदम प्रवाह cytometric विश्लेषण का एक उदाहरण शामिल हैं । एक मध्यम आकार के प्रयोग के लिए (10 दिलों) प्रक्रिया के पूरा होने की आवश्यकता है 2 – 3 h.
Introduction
कोरोनर (ischemia reperfusion या रोधगलन) और गैर-कोरोनरी (उच्च रक्तचाप या मायोकार्डिटिस) सहित रोधगलन तनाव या चोट के विभिन्न रूपों, प्रतिकारक और सुरक्षात्मक के साथ भड़काऊ कोशिकाओं की भर्ती को बढ़ावा देने, लेकिन यह भी रोगजनक गुण । १८९१ के रूप में जल्दी के रूप में, Romberg पहले सेलुलर की उपस्थिति का वर्णन सन्निपात और लाल रंग बुखार से संक्रमित रोगियों की मायोकार्डियम में घुसपैठ1। तथापि, हृदय प्रतिरक्षा कोशिकाओं के विस्तृत अध्ययन और अधिक उन्नत immunophenotyping तकनीकों के विकास की आवश्यकता. एक परिणाम के रूप में, केवल हाल ही में हम समझते है कि स्थिर राज्य के दौरान आवश्यक रखरखाव भूमिकाओं के साथ प्रतिरक्षा कोशिकाओं की एक विविध जनसंख्या मायोकार्डियम के भीतर रहता शुरू कर दिया है ।
प्रोटोकॉल गया है, और अभी भी है, सबसे आम विधि सूजन के दौरान हृदय प्रतिरक्षा कोशिकाओं को चिह्नित करने के लिए । हालांकि, जबकि प्रोटोकॉल एक मूल्यवान नैदानिक उपकरण का प्रतिनिधित्व करता है, हृदय प्रतिरक्षा कोशिकाओं के अध्ययन में इसके उपयोग की महत्वपूर्ण सीमाएं हैं । मायोकार्डियम में रहने वाले प्रतिरक्षा कोशिकाओं कुल कोशिकाओं के एक बहुत छोटे अनुपात का प्रतिनिधित्व करते हैं और अधिक या कम समान रूप से एक आनुपातिक अपार अंतरिक्ष में वितरित कर रहे हैं. इसी तरह, वायरल मायोकार्डिटिस के रूप में हृदय शोथ, के कई रूपों, सूजन के फोकल पैटर्न दिखाते हैं । इसका मतलब यह है कि दिल की प्रतिरक्षा प्रणाली के सटीक विश्लेषण अक्सर ऊतकवैज्ञानिक नमूना की उच्च डिग्री की आवश्यकता होती है, पूर्वाग्रह को कम करने के लिए लागत में वृद्धि. इसके अलावा, प्रोटोकॉल सेल पहचान में प्रयोग करने योग्य जानकारी का एक बहुत ही सीमित मात्रा प्रदान करता है (पैरामीटर की संख्याउदा ) । सेल उपसमुच्चय है कि कई अभिव्यक्ति मार्करों (सतह मार्कर, प्रतिलेखन कारकों या गुप्त अणुओं सहित) के उपयोग की आवश्यकता होती है की एक बढ़ती संख्या के साथ, प्रवाह cytometry खुद immunophenotyping के लिए सबसे शक्तिशाली उपकरण के रूप में स्थापित किया गया है, कम लागत और उच्च प्रवाह के कारण ।
immunophenotyping तकनीक का उपयोग कुशल पाचन प्रोटोकॉल है कि कोशिकाओं की बड़ी संख्या के एकल कोशिकाओं के विश्लेषण के लिए अनुमति के विकास पर बारीकी से निर्भर है । कोशिका निष्कर्षण के संपूर्ण प्रोटोकॉल के विकास कार्डियक इम्यूनोलॉजी के अध्ययन में अवसरों की एक नई विंडो खोला । पाचन, प्रवाह cytometry और transcriptomics के संयोजन के माध्यम से, दिल में रहने वाले मैक्रोफेज और वृक्ष कोशिकाओं की प्रमुख आबादी2,3विशेषता है । स्थिर राज्य के दौरान हृदय प्रतिरक्षा कोशिकाओं की सबसे प्रचुर जनसंख्या CD64+MerTK+ मैक्रोफेज, जो आगे CCR2 या CD11c2की अपनी अभिव्यक्ति के आधार पर विभाजित किया जा सकता है । CCR2+ मैक्रोफेज वयस्क अस्थि मज्जा hematopoiesis से उत्पंन, CCR2 के बहुमत– मैक्रोफेज, जो MHC के उच्च या निंन स्तर-द्वितीय व्यक्त कर सकते हैं, जंम के पूर्व मूल के मुख्य रूप से कर रहे हैं । मैक्रोफेज की मरंमत4 और चोट के दौरान5 मलबे को हटाने या स्थिर राज्य में बिजली कनेक्टिविटी6 का समर्थन करने के रूप में महत्वपूर्ण कार्य करते हैं । सूजन के विभिन्न रूपों के दौरान Ly6Chi MHC-IIlo CD64int monocytes की एक महत्वपूर्ण आमद होती है, जो बाद में अंतर Ly6Chi CCR2+ मैक्रोफेज2,7 . एक काफी छोटे, लेकिन महत्वपूर्ण, स्वस्थ व्यक्तियों के मायोकार्डियम में रहने वाले कोशिकाओं की जनसंख्या वृक्ष कोशिकाओं8,9से बना है । कार्डिएक पारंपरिक dc (cDCs) के दो प्रमुख सबसेट हाल ही में विशेषता की गई है: cDC1 (CD103+ dc) और cDC2 (CD11b+ dc) । dc संक्रमण के खिलाफ रक्षा में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं8 लेकिन यह भी सूजन के दौरान आत्म चोट को बढ़ावा देने कर सकते हैं, विशेष रूप से रोधगलन9के दौरान.
यहां, हम माउस मायोकार्डियम से व्यवहार्य हृदय प्रतिरक्षा कोशिकाओं के अलगाव के लिए एक सरल विधि का वर्णन । विधि एंजाइमी और यांत्रिक पाचन एक सेल के साथ जोड़ती है-छलनी निस्पंदन क्रम में एक एकल सेल निलंबन है कि विश्लेषण किया जा सकता है प्राप्त करने के लिए, या आगे शुद्ध, प्रवाह cytometry छंटाई या चुंबकीय मनका संवर्धन द्वारा । extravascular रोधगलन की सटीक माप कार्डियक microvasculature के खून से संभावित दूषित पदार्थों को दूर करने के क्रम में हृदय छिड़काव की आवश्यकता होती है । इसके अलावा, हम प्रतिरक्षा कोशिकाओं के intravascular लेबलिंग का एक वैकल्पिक कदम है कि आगे intravascular दूषित पदार्थों से रोधगलन, Galkina एट अल. प्रोटोकॉल पर आधारित में अंतर करने के लिए इस्तेमाल कियाजा सकता वर्तमान । अंत में, हम प्रमुख मैक्रोफेज और सीडीसी उपआबादी की पहचान करने के लिए एक बुनियादी प्रवाह cytometry विश्लेषण प्रस्तुत करते हैं ।
Protocol
Representative Results
Discussion
रोधगलन, या मायोकार्डिटिस, सबसे हृदय रोगों की एक विशेषता है । हालांकि, मायोकार्डियम गैर रोग राज्यों में अपने स्वयं के प्रतिरक्षा घटकों से रहित नहीं है । स्थिर राज्य के दौरान, कई प्रतिरक्षा कोशिकाओं माय?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम (१४८८०८ और १४८७९२) स्वास्थ्य अनुसंधान के कनाडाई संस्थानों द्वारा समर्थित किया गया था, एसई एक दिल और स्ट्रोक फाउंडेशन, ओंटारियो प्रांतीय कार्यालय, पैसा का मार्च, टेड रोजर्स हार्ट रिसर्च और पीटर मंक के लिए केंद्र से कार्मिक पुरस्कार द्वारा समर्थित किया गया था कार्डिएक सेंटर । XCC एक CIHR बंटिंग फेलोशिप रखती है । ला एक दिल और स्ट्रोक/रिचर्ड लेवार छात्र पुरस्कार रखती है ।
Materials
| Phosphate buffered saline | Wisent | 311-010-CL | 1x PBS |
| 21Gx 1 1/2 (0.8mmx40mm) PrecisionGlide Needle | BD | 305167 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Wisent | 311-511-CL | 1x HBSS |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A4503-50G | |
| Bovine serum | Sigma | B9433 | |
| 0.5M Ethylenediaminetetraacetic acid | BioShop | EDT111 | |
| Vacuum filter , 0.2 µm Filtropur V50 | Sarstedt | 83.1823.001 | |
| 28G 1/2 1 cc insulin syringe | BD | 329424 | |
| 60 mL syringe | BD | 309653 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Wisent | 319-005-CL | 1x DMEM with 4.5 g/L glucose and L-Glutamine and Sodium Pyruvate |
| Collagenase I | Sigma | C0130 | from Clostridium histolyticum |
| Hyaluronidase type I-S | Sigma | H3506 | |
| DNase-I | Sigma | D4513 | from bovine pancreas |
| Cell strainer, 40 µm Nylon | Falcon | 352340 | |
| Ammonium-Chloride- Potassium (ACK) lysis buffer | Lonza | 10-546E | |
| Alexa Fluor 700 anti-mouse/human CD11b | Biolegend | 101222 | 1:250 dilution |
| APC/Cy7 anti-mouse Ly-6c | Biolegend | 128025 | 1:250 dilution |
| APC anti-mouse CD103 | Biolegend | 121414 | 1:250 dilution |
| Brilliant Violet 605 anti-mouse CD11c | Biolegend | 117334 | 1:250 dilution |
| PE anti-mouse Ly-6G | Biolegend | 127607 | 1:250 dilution |
| Pacific Blue anti-mouse I-Ab | Biolegend | 116422 | 1:250 dilution |
| FITC anti-mouse CD64 (FcgRI) | Biolegend | 139315 | 1:250 dilution |
| PE/Cy7 anti-mouse CD45 | Biolegend | 103113 | 1:250 dilution |
| PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD45 | Biolegend | 103132 | 1:40 dilution |
| TruStain fcX (anti-mouse CD16/32) | Biolegend | 101320 | 1:100 dilution |
| True-Stain Monocyte Blocker | Biolegend | 426101 | 1:20 dilution |
| FlowJo V10 | TreeStar Inc | https://www.flowjo.com/solutions/flowjo | |
| Mouse: Batf3-/- | The Jackson Laboratory | JAX: 013755 |
References
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