Isolasjon og identifisering av ekstravaskulær overvåking av immunceller av hjertet

Summary

Denne protokollen gir en enkel og effektiv metode for å isolere, identifisere og kvantifisere immunceller bosatt i myokard mus i steady state eller betennelse. Protokollen kombinerer enzymatisk og mekanisk fordøyelsen for generering av en enkelt celle suspensjon som kan analyseres videre av flowcytometri.

Abstract

Immunsystemet er en vesentlig komponent i et sunt hjerte. Myocardium er hjem til en rik befolkning på ulike immun celle delsett med funksjonell compartmentalization både under steady state og under ulike former for betennelse. Inntil nylig studiet av immunceller i hjertet krevde bruk av mikroskopi eller dårlig utviklede fordøyelsen protokoller, som gitt nok følsomhet under alvorlig betennelse, men klarte ikke å trygt identifisere små, men viktige-av celler i løpet stabil state. Her diskuterer vi en enkel metode kombinere enzymatisk (collagenase, hyaluronidase og DNAse) og mekanisk fordøyelsen murine hjerter foran intravascular administrasjonen av fluorescently merket antistoffer å skille små men uunngåelig intravascular celle forurensninger. Denne metoden genererer en suspensjon av isolerte levedyktig celler som kan analyseres av flowcytometri for identifikasjon, phenotyping og kvantifisering eller ytterligere renset med fluorescens-aktivert celle sortering eller magnetiske perle separasjon for transcriptional analyse eller i vitro studier. Vi inkluderer et eksempel på en trinnvis flyt cytometric analyse å skille de viktige macrophage og dendrittiske celle populasjoner av hjertet. En middels størrelse eksperiment (10 hearts) krever fullført prosedyren 2-3 h.

Introduction

Ulike former for hjerteinfarkt stress eller skader, inkludert iskemiske (ischemia reperfusion eller hjerteinfarkt) og ikke-iskemiske (hypertensjon eller Myokarditt), fremme rekruttering av inflammatoriske celler med reparative og beskyttende, men også patogene egenskaper. Så tidlig som i 1891, beskrevet Romberg først tilstedeværelsen av mobilnettet infiltrerer i myokard pasienter infisert av tyfus og skarlagensfeber¹. Den detaljerte studien av cardiac immunceller kreves imidlertid utviklingen av mer avanserte immunophenotyping teknikker. Som en konsekvens, har nylig vi begynt å forstå at et mangfoldig befolkning av immunceller med grunnleggende vedlikehold roller i løpet stabil state ligger innenfor myokard.

Histology har vært og fortsatt er, den vanligste metoden å karakterisere kardial immunceller ved betennelser. Men mens histology representerer en verdifull diagnoseverktøyet, har dens bruk i studiet av cardiac immunceller viktige begrensninger. Immunceller i myokard representerer en svært liten andel av de totale cellene og er mer eller mindre jevnt fordelt i løpet proporsjonalt enorme. Tilsvarende vise flere former for hjerte inflammasjon, som viral Myokarditt, fokal mønstre av betennelse. Dette betyr at nøyaktig analyse av immunsystemet til hjertet ofte krever høyere grader av histologiske sampling, øke kostnadene for å redusere bias. Videre gir histology et svært begrenset antall brukbare informasjon i cellen identifikasjon (f.eks antall parametere). Med en stadig økende antall celle undergrupper som krever bruk av flere uttrykk markører (inkludert overflate markører, transkripsjonsfaktorer eller utskilles molekyler), har flowcytometri etablert seg som det mest effektive verktøyet for immunophenotyping, på grunn av lav pris og høy gjennomstrømming.

Bruk av immunophenotyping teknikker er tett avhengige av utviklingen av effektiv fordøyelse protokoller som tillates for single-celler analyse av stort antall celler. Utviklingen av uttømmende protokoller celle utvinning åpnet et nytt vindu av muligheter i studiet av cardiac immunologi. Gjennom en kombinasjon av fordøyelsen, flowcytometri og transcriptomics, har store bestander av makrofager og dendrittiske celler i hjertet vært preget^2,3. Den rikeste befolkningen i cardiac immunceller i løpet stabil state er CD64⁺MerTK⁺ makrofager, som kan deles basert på deres gjengivelsen av CCR2 eller CD11c². CCR2⁺ makrofager kommer fra voksen benmarg hematopoiesis, mens fleste av CCR2^– makrofager, som kan uttrykke høyt eller lavt nivå av MHC-II, er hovedsakelig av prenatal opprinnelse. Makrofager utføre viktige funksjoner som reparasjon⁴ og fjerning av rusk⁵ under skade eller støtte elektrisk tilkobling⁶ i steady state. Under ulike former for betennelse en viktig strøm av Ly6C^Hei MHC-II^lo CD64^int monocytter oppstår, som senere skille ut Ly6C^Hei CCR2⁺ makrofager^2,7 . Betydelig mindre, men viktig innbyggere bor i myokard av friske individer består av dendrittiske celler^8,9. De to store delsettene av cardiac konvensjonelle DCs (cDCs) har vært nylig preget: cDC1 (CD103⁺ DCs) og cDC2 (CD11b⁺ DCs). DCs spille en viktig rolle i forsvaret mot infeksjon⁸ , men kan også fremme Selvskading ved betennelser, spesielt under hjerteinfarkt⁹.

Her beskriver vi en enkel metode for isolering av levedyktig cardiac immunceller fra musen myokard. Metoden kombinerer enzymatisk og mekanisk fordøyelsen med en celle-sil filtrering for å få en enkeltcelle suspensjon som kan analyseres, eller videre renset, ved flyt cytometri sortering eller magnetiske perle berikelse. Nøyaktige målinger av ekstravaskulær overvåking av hjerteinfarkt celler krever cardiac perfusjon for å fjerne mulige forurensninger fra blodet av cardiac microvasculature. I tillegg presenterer vi et valgfritt trinn av intravascular merking av immunceller som kan brukes til å fremme skille ut hjerteinfarkt celler fra intravascular forurensning, basert på Galkina et al. protokollen¹⁰. Til slutt presenterer vi en grunnleggende flyt cytometri analyse for å identifisere de store macrophage og cDC subpopulasjoner.

Protocol

Etikk uttalelse: denne protokollen er vurdert og godkjent av dyr omsorg komiteen på universitetet helse Network (Toronto, Canada) og er i overensstemmelse med kanadiske Rådet for Animal Care. 1. buffer forberedelse Forberede HBB buffer (Hanks balansert Salt løsning (HBSS), 2% varme inaktivert bovin serum, 0,2% bovin serum albumin). Legge 10 mL av varme inaktivert bovin serum og 1 g bovin serum albumin til 500 mL av HBSS. Filteret sterilisere gjennom en 0,2 µm og lagre på 4 ° C….

Representative Results

Hittil er ingen god metode utviklet isolere immunceller fra andre cardiac celle komponenter, for eksempel cardiomyocytes. Dermed krever analyse av cardiac enkeltcelle suspensjon av flowcytometri en pre gating med CD45 identifiserer immun celle, etterfulgt av én celle og liten størrelse utelukkelse gating (figur 1A). Alternativt kan en levedyktighet flekker utføres for å utelate døde celler. Liten størrelse eksklusjon og levedyktighet fa…

Discussion

Hjerteinfarkt betennelse eller Myokarditt, er en funksjon av mest hjerte-og karsykdommer. Myocardium er imidlertid ikke uten sin egen immun komponenter i ikke-sykdom stater. I steady state, mange immunceller ligge i myokard og spille viktige roller av vedlikehold og beskyttelse. Karakterisering av disse forskjellige befolkningsgrupper celleområde ville ikke vært mulig uten metoder som den som presenteres i denne protokollen.

En kombinasjon av mekanisk og enzymatiske fordøyelsen av myokard t…

Materials

Phosphate buffered saline	Wisent	311-010-CL	1x PBS
21Gx 1 1/2 (0.8mmx40mm) PrecisionGlide Needle	BD	305167
Hank’s Balanced Salt Solution	Wisent	311-511-CL	1x HBSS
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A4503-50G
Bovine serum	Sigma	B9433
0.5M Ethylenediaminetetraacetic acid	BioShop	EDT111
Vacuum filter , 0.2 µm Filtropur V50	Sarstedt	83.1823.001
28G 1/2 1 cc insulin syringe	BD	329424
60 mL syringe	BD	309653
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Wisent	319-005-CL	1x DMEM with 4.5 g/L glucose and L-Glutamine and Sodium Pyruvate
Collagenase I	Sigma	C0130	from Clostridium histolyticum
Hyaluronidase type I-S	Sigma	H3506
DNase-I	Sigma	D4513	from bovine pancreas
Cell strainer, 40 µm Nylon	Falcon	352340
Ammonium-Chloride- Potassium (ACK) lysis buffer	Lonza	10-546E
Alexa Fluor 700 anti-mouse/human CD11b	Biolegend	101222	1:250 dilution
APC/Cy7 anti-mouse Ly-6c	Biolegend	128025	1:250 dilution
APC anti-mouse CD103	Biolegend	121414	1:250 dilution
Brilliant Violet 605 anti-mouse CD11c	Biolegend	117334	1:250 dilution
PE anti-mouse Ly-6G	Biolegend	127607	1:250 dilution
Pacific Blue anti-mouse I-Ab	Biolegend	116422	1:250 dilution
FITC anti-mouse CD64 (FcgRI)	Biolegend	139315	1:250 dilution
PE/Cy7 anti-mouse CD45	Biolegend	103113	1:250 dilution
PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD45	Biolegend	103132	1:40 dilution
TruStain fcX (anti-mouse CD16/32)	Biolegend	101320	1:100 dilution
True-Stain Monocyte Blocker	Biolegend	426101	1:20 dilution
FlowJo V10	TreeStar Inc		https://www.flowjo.com/solutions/flowjo
Mouse: Batf3-/-	The Jackson Laboratory	JAX: 013755