Isolering og identifikation af ekstravaskulære immunceller af hjertet

Summary

Denne protokol udgør en enkel og effektiv metode til at isolere, identificere og kvantificere immunceller bosat i myokardiet af mus under steady state eller betændelse. Protokollen kombinerer enzymatiske og mekaniske fordøjelsen for generation af en enkelt cellesuspension, der yderligere kan analyseres ved flowcytometri.

Abstract

Immunsystemet er et væsentligt element i et sundt hjerte. Myokardiet er hjemsted for en rig bestand af forskellige immun celle subsets med funktionel opdeling både under steady state og under forskellige former for inflammation. Indtil for nylig, studiet af immunceller i hjertet krævede anvendelse af mikroskopi eller dårligt udviklede fordøjelsen protokoller, som forudsat nok følsomhed under alvorlig betændelse men var afskåret fra trygt identificere små — men nøgle — populationer af celler under steady state. Her diskuterer vi en simpel metode kombinerer enzymatisk (collagenase, hyaluronidase og DNAse) og mekanisk fordøjelsen af murine hjerter foranstillet intravaskulær administration af fluorescently-mærkede antistoffer til at skelne små men uundgåelige intravaskulær celle forureninger. Denne metode genererer en suspension af isolerede levedygtige celler, der kan analyseres ved flowcytometri til identifikation, fænotyper og kvantificering eller yderligere renset med fluorescens-aktiveret celle sortering eller magnetisk bead adskillelse for transkriptionel analyse eller in vitro- undersøgelser. Vi har et eksempel på en trinvis flow cytometric analyse til at differentiere de centrale makrofager og dendritiske cellepopulationer af hjertet. For en mellemlang mellemstore eksperiment (10 hjerter) kræver afslutningen af proceduren, der 2-3 h.

Introduction

Forskellige former for Myokardie stress eller skade, herunder iskæmisk (iskæmi reperfusion eller myokardieinfarkt) og ikke-iskæmisk (hypertension eller Myokarditis), fremme af ansættelse af inflammatoriske celler med reparative og beskyttende, men også sygdomsfremkaldende egenskaber. Allerede i 1891, beskrevet Romberg først tilstedeværelsen af cellulære infiltrater i myokardiet hos patienter smittet med tyfus og skarlagensfeber¹. Men den detaljerede undersøgelse af hjertets immunceller kræves udvikling af mere avancerede Immunofænotypning-teknikker. Som en konsekvens, har først for nylig vi begyndte at forstå, at en forskelligartet befolkning på immunceller med vigtig vedligeholdelse roller under steady state er bosat inden for myokardiet.

Histologi har været og stadig er den mest almindelige metode til at karakterisere hjerte immunceller under betændelse. Men mens histologi repræsenterer et værdifuldt diagnostisk redskab, dets anvendelse i studiet af cardiac immunceller har vigtige begrænsninger. Immunceller bosat i myokardiet repræsenterer en meget lille andel af de samlede celler og er mere eller mindre jævnt fordelt i et forholdsmæssigt enorme rum. Tilsvarende vis flere former for hjerte betændelse, såsom viral myocarditis, fokale mønstre af betændelse. Det betyder, at præcis analyse af immunsystemet af hjertet ofte kræver højere grader af histologiske prøveudtagning, øger omkostningen ved at reducere bias. Derudover giver histologi en meget begrænset mængde brugbar information i celle identifikation (f.eks. antallet af parametre). Med et stadigt stigende antal celle subsets, der kræver brug af flere udtryk markører (herunder celleoverflademarkører, transkriptionsfaktorer eller udskilles molekyler), har flowcytometri etableret sig som den mest kraftfulde værktøj til Immunofænotypning, på grund af lave omkostninger og høj overførselshastighed.

Brugen af Immunofænotypning teknikker er stærkt afhængige af udviklingen af effektiv fordøjelse protokoller, der er tilladt for single-celler analyse af et stort antal celler. Udviklingen af udtømmende protokoller af celle udvinding åbnes et nyt vindue af muligheder i studiet af cardiac immunologi. Gennem kombinationen af fordøjelsen, flowcytometri og transcriptomics, har de store populationer af makrofager og dendritiske celler bosat i hjertet blevet karakteriseret^2,3. Den mest rigelige befolkning af cardiac immunceller under steady state er CD64⁺MerTK⁺ makrofager, der yderligere kan inddeles baseret på deres udtryk for CCR2 eller CD11c². CCR2⁺ makrofager stammer fra voksne knoglemarv bloddannelsen, mens fleste af CCR2^– makrofager, der kan udtrykke høje eller lave niveauer af MHC-II, er hovedsagelig af prænatal oprindelse. Makrofager udføre vigtige funktioner såsom reparation⁴ og fjernelse af vragdele⁵ under skade eller støtte elektrisk connectivity⁶ i steady state. Forskellige former for inflammation en vigtig tilstrømning af Ly6C^Hej MHC-II^lo CD64^int monocytter forekomme, som senere differentiere i Ly6C^Hej CCR2⁺ makrofager^2,7 . En betydeligt mindre, men vigtige, befolkningen i celler bosat i myokardiet af sunde individer er sammensat af dendritiske celler^8,9. De to store delmængder af cardiac konventionelle DCs (cDCs) har været for nylig præget: cDC1 (CD103⁺ DCs) og cDC2 (CD11b⁺ DCs). DCs spiller en vigtig rolle i forsvaret mod infektion⁸ men kan også fremme self-skade under betændelse, især under myokardieinfarkt⁹.

Her, beskriver vi en simpel metode til dyrkning af levedygtige hjerte immunceller fra musen myokardiet. Metoden kombinerer enzymatiske og mekaniske fordøjelse med en celle-si filtrering for at opnå en enkelt cellesuspension, der kan analyseres, eller yderligere renset af flow flowcytometri sortering eller magnetisk bead berigelse. Præcise målinger af ekstravaskulære Myokardie celler kræver hjerte perfusion for at fjerne eventuelle forureninger fra blodbanen i hjertets microvasculature. Derudover præsenterer vi et valgfrit trin af intravaskulære mærkning af immunceller, der kan bruges til at differentiere yderligere Myokardie celler fra intravaskulær forureninger, baseret på Galkina et al. protokol¹⁰. Endelig præsenterer vi en grundlæggende flow flowcytometri analyse for at identificere de store makrofag og cDC delpopulationer.

Protocol

Etik erklæring: denne protokol har gennemgået og godkendt af Animal Care Udvalget på University Health Network (Toronto, Canada) og er i overensstemmelse med den canadiske Rådet på Animal Care. 1. buffer forberedelse Forberede Ulla buffer (Hank’s Balanced Salt løsning (HBSS), 2% varme inaktiveret bovint serum, 0,2% bovint serumalbumin). Tilsæt 10 mL af varme inaktiveret bovint serum og 1 g af bovint serumalbumin 500 ml HBSS. Filter sterilisere gennem en 0,2 µm filter og opbev…

Representative Results

Til dato, er ingen god metode designet til at isolere immunceller fra andre kardiale celle komponenter, såsom cardiomyocytes. Analyse af den kardiale enkelt cellesuspension ved flowcytometri kræver derfor en pre gating med CD45 at identificere immun cellepopulationer, efterfulgt af enkelt celle og lille størrelse udstødelse gating (fig. 1A). Alternativt, en levedygtighed farvning kan udføres for at udelukke døde celler. Lille størrelse…

Discussion

Myokardial betændelse eller myocarditis, er en funktion af mest hjerte-kar-sygdomme. Myokardiet er imidlertid ikke sin egen immunkomponenter i ikke-sygdomstilstande. I steady state, mange immunceller bor i myokardiet og spille de afgørende roller i vedligeholdelse og beskyttelse. Karakterisering af disse forskelligartede befolkningsgrupper af celler ville ikke have været muligt uden metoder som præsenteres i denne protokol.

En kombination af mekanisk og Enzymatisk nedbrydning af myokardiet…

Materials

Phosphate buffered saline	Wisent	311-010-CL	1x PBS
21Gx 1 1/2 (0.8mmx40mm) PrecisionGlide Needle	BD	305167
Hank’s Balanced Salt Solution	Wisent	311-511-CL	1x HBSS
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A4503-50G
Bovine serum	Sigma	B9433
0.5M Ethylenediaminetetraacetic acid	BioShop	EDT111
Vacuum filter , 0.2 µm Filtropur V50	Sarstedt	83.1823.001
28G 1/2 1 cc insulin syringe	BD	329424
60 mL syringe	BD	309653
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Wisent	319-005-CL	1x DMEM with 4.5 g/L glucose and L-Glutamine and Sodium Pyruvate
Collagenase I	Sigma	C0130	from Clostridium histolyticum
Hyaluronidase type I-S	Sigma	H3506
DNase-I	Sigma	D4513	from bovine pancreas
Cell strainer, 40 µm Nylon	Falcon	352340
Ammonium-Chloride- Potassium (ACK) lysis buffer	Lonza	10-546E
Alexa Fluor 700 anti-mouse/human CD11b	Biolegend	101222	1:250 dilution
APC/Cy7 anti-mouse Ly-6c	Biolegend	128025	1:250 dilution
APC anti-mouse CD103	Biolegend	121414	1:250 dilution
Brilliant Violet 605 anti-mouse CD11c	Biolegend	117334	1:250 dilution
PE anti-mouse Ly-6G	Biolegend	127607	1:250 dilution
Pacific Blue anti-mouse I-Ab	Biolegend	116422	1:250 dilution
FITC anti-mouse CD64 (FcgRI)	Biolegend	139315	1:250 dilution
PE/Cy7 anti-mouse CD45	Biolegend	103113	1:250 dilution
PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD45	Biolegend	103132	1:40 dilution
TruStain fcX (anti-mouse CD16/32)	Biolegend	101320	1:100 dilution
True-Stain Monocyte Blocker	Biolegend	426101	1:20 dilution
FlowJo V10	TreeStar Inc		https://www.flowjo.com/solutions/flowjo
Mouse: Batf3-/-	The Jackson Laboratory	JAX: 013755