Hier presenteren we een protocol voor de beoordeling van de organisatie van de astrocytic netwerken. De beschreven methode minimaliseert bias om beschrijvende maatregelen van deze netwerken zoals cellen, grootte, ruimte en positie binnen een kern. Anisotropie is beoordeeld met een vectoriële analyse.
Het steeds duidelijker dat astrocyten neuronale functie niet alleen de synaptic en eencellige niveau, maar ook op netwerkniveau moduleren geworden. Astrocyten zijn sterk met elkaar verbonden via gap kruispunten en koppeling door middel van deze kruispunten is dynamisch en sterk gereguleerde. Een opkomende concept is dat astrocytic functies zijn gespecialiseerd en aangepast aan de functies van de neuronale circuit waaraan ze gekoppeld zijn. Methoden voor het meten van verschillende parameters van astrocytic netwerken zijn daarom nodig om de regels inzake hun communicatie en het koppelen van beter te beschrijven en te begrijpen verder hun functies.
Hier, met behulp van de software van de analyse van de afbeelding (bijv., ImageJFIJI), beschrijven we een methode voor het analyseren van de confocal beelden van astrocytic netwerken geopenbaard door kleurstof-koppeling. Deze methoden voldoende zijn voor de detectie van 1) een geautomatiseerde en onbevooroordeelde van gelabelde cellen, 2) de berekening van de grootte van het netwerk, 3) berekening van het preferentiële oriëntatie van kleurstof verspreiden binnen het netwerk, en 4) herpositionering van het netwerk binnen het interessegebied .
Deze analyse kan worden gebruikt voor karakteriseren astrocytic netwerken van een bepaald gebied, vergelijken van netwerken van verschillende gebieden gekoppeld aan verschillende functies of netwerken die zijn verkregen onder verschillende omstandigheden die verschillende gevolgen voor koppeling hebben vergelijken. Deze opmerkingen kunnen leiden tot belangrijke functionele overwegingen. Bijvoorbeeld, analyseren we de astrocytic netwerken van de celkern, waar we eerder hebben aangetoond dat er sprake is van essentieel belang voor het vermogen van de neuronen te schakelen hun afvuren patronen van tonic op ritmische barst1astrocytic koppeling. Door het meten van de omvang, opsluiting en preferentiële afdrukstand van astrocytic netwerken in deze kern, kunnen we bouwen hypothesen over functionele domeinen die zij omschrijven. Meerdere studies suggereren dat verschillende andere hersengebieden, met inbegrip van het vat cortex, laterale superieure olijf-, olfactorische glomeruli, en zintuiglijke kernen in de thalamus en de visuele cortex, wat te noemen, van een soortgelijke analyse profiteren kunnen.
Vele studies hebben beschreven hoe de neuron-Astrocyt dialoog op een sub cellulaire of synaptic niveau kan gevolgen hebben in neuronale functies en synaptische transmissie. Het is reeds lang gevestigd dat de astrocyten gevoelig zijn aan het omringen van neuronale activiteit; in feite, hebben ze receptoren voor vele neurotransmitters, met inbegrip van glutamaat, GABA acetylcholine en ATP (zie eerder gepubliceerde beoordelingen2,3,4). In ruil daarvoor verwerkt astrocytic ensheath synaptic elementen en invloed Neuronale activiteit beide er en extrasynaptic plaatsen door regulering van de extracellulaire Ionische homeostase en het vrijgeven van verschillende factoren of zenders zoals glutamaat, D-serine en ATP 5 , 6 , 7.
Het idee dat de astrocyten ook neuronale functie op netwerkniveau kunnen moduleren is ontstaan, met bewijs dat astrocytic koppeling is ruimtelijk gereguleerd en komt met de neuronale segmentatie in gebieden gekenmerkt door een duidelijke anatomische overeen Brandcompartimentering (zoals gebieden met sensorische vertegenwoordigingen), die aangeeft dat de astrocyten zullen koppelen aan andere astrocyten dienen dezelfde functie in plaats van alleen die dicht in de buurt. In de laterale superieure olive, bijvoorbeeld, zijn meest astrocytic netwerken gericht orthogonaal op de tonotopic as8, overwegende dat communicatie tussen de astrocyten in het vat cortex of olfactoty glomeruli, veel sterker in vaten of glomeruli en zwakker tussen aangrenzende degenen9,10. In beide gevallen zijn de astrocytic netwerken gericht op het midden van de glomerule of vat9,10.
We onlangs bleek dat de astrocytic activiteit neuronale afvuren moduleert door het verlagen van de concentratie van extracellulaire Ca2 + ([Ca2 +]e), vermoedelijk door de vrijlating van S100β, een Ca2 +-bindende eiwit11. Dit effect, die werd aangetoond in een populatie van de rhythmogenic neuronen in het dorsale deel van de de belangrijkste zintuiglijke nucleus (NVsnpr, dacht dat een belangrijke rol in de generatie van Triggerpunten bewegingen), het gevolg van het feit dat ritmische afvuren in deze neuronen is afhankelijk van een persistent nb+ huidige die wordt bevorderd door afname van [Ca2 +]e11,12. Ritmische afvuren in deze neuronen kan “fysiologisch” ontlokte worden door stimulatie van hun ingangen of kunstmatige verlaging van [Ca2 +]e. We verder bleek dat astrocytic koppeling vereist voor neuronale ritmische vuren1. Dit gewag gemaakt van de mogelijkheid dat astrocytic netwerken omgeschreven functionele domeinen waar Neuronale activiteit kan worden gesynchroniseerd en gecoördineerd kunnen vormen. Om te beoordelen deze hypothese, moesten we eerst het ontwikkelen van een methode om te rigoureus het documenteren van de organisatie van deze netwerken binnen NVsnpr.
Eerdere studies op astrocytic netwerken hebben meestal de omvang van de koppeling in termen van aantal cellen en de dichtheid en het verdragsgebied beschreven. Pogingen om de vorm van astrocytic netwerken en de richting van kleurstof-koppeling te evalueren werden vooral uitgevoerd door vergelijking van de grootte van de netwerken langs twee assen (x en y) in het vat cortex9, hippocampus13,14, 15, barreloid velden van de thalamus16, laterale superieure olijf8, olfactorische glomeruli10en cortex14. De hier beschreven methoden inschakelen onbevooroordeelde graven van gelabelde cellen in een netwerk en een schatting van het terrein dat ze bestrijken. We ook ontwikkeld instrumenten de voorkeur richting van koppeling binnen een netwerk te definiëren en te beoordelen of de gewenste afdrukstand naar het centrum van de kern of in een andere richting is. In vergelijking met de eerder gebruikte methoden biedt dit protocol een manier om te beschrijven van de organisatie en de oriëntatie van de astrocytic netwerken in structuren zoals de dorsale trigeminal belangrijkste zintuiglijke kern die nog geen een duidelijke anatomische bekend overheidsdepartementen. In de bovenstaande studies, de oriëntatie van het netwerk wordt beschreven als een relatie aan de vorm van de structuur zelf, die is al gedocumenteerd (bv., de barreloid in de thalamus, vaten in de cortex, lagen in de hippocampus en de cortex, de glomeruli in de bulbus olfactorius, enz.). Daarnaast voorziet het vectoriële analyse vergelijkingen oriëntaties onthuld onder verschillende omstandigheden te koppelen. Als u wilt analyseren of deze parameters gewijzigd volgens het standpunt van het netwerk binnen de kern, ontwikkelden we ook een methode ter vervanging van elk netwerk met betrekking tot de grenzen van de kern. Deze hulpprogramma’s kunnen gemakkelijk worden aangepast aan andere gebieden voor behandelende netwerken van gekoppelde cellen.
Er bestaan een aantal elektrofysiologische methoden voor de beoordeling van functionele koppeling tussen astrocyten23,24. Deze methoden geven echter geen informatie over de anatomische indeling van de astrocytic netwerken. Een aantal studies hebben reeds aangetoond dat “kleurstof – of tracer-koppeling”, zoals gedaan hier, alleen op in een fractie van combinatie van cellen die zijn gedetecteerd door elektrofysiologische methoden25,</su…
The authors have nothing to disclose.
Dit werk wordt gefinancierd door de Canadese instituten van gezondheidsonderzoek, Grant/Award nummer: 14392.
NaCl | Fisher Chemicals | S671-3 | |
KCl | Fisher Chemicals | P217-500 | |
KH2PO4 | Fisher Chemicals | P285-500 | |
MgSO4 | Fisher Chemicals | M65-500 | |
NaHCO3 | Fisher Chemicals | S233-500 | |
C6H12O6 Dextrose anhydrous | Fisher Chemicals | D16-500 | |
CaCl2 dihydrated | Sigma | C70-500 | |
Sucrose | Sigma | S9378 | |
D-gluconic acid potassium salt | Sigma | G45001 | |
MgCl2 anhydrous | Sigma | M8266 | |
HEPES | Sigma | H3375 | |
EGTA | Sigma | E4378 | |
ATPTris Salt | Sigma | A9062 | |
GTPTris Salt | Sigma | G9002 | |
Biocytin | Sigma | B4261 | |
Carbenoxolone disodium salt | Sigma | C4790 | |
avidin-biotin complex : ABC kit | Vestor laboratories | PK-4000 | |
Streptavidine-alexa 594 | Molecular Probes | S11227 | |
Triton | Fisher Chemicals | BP151-500 | |
Xylene | Fisher Chemicals | X5-1 | |
Aqueous mounting medium 1 : Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
Toluen-based synthetic resin mounting medium : Permount | Fisher Chemicals | SP15-100 | |
Slide Drying Bench | Fisherbrand | 11-474-470 | |
Vibratome | Leica | VT 1000S | |
Microscope cover glass | Fisherbrand | 12-544A | |
Microscope slide ColorFrost | Fisherbrand | 12-550-413 | |
PFA | Fisherchemicals | 04042-500 | |
Olympus FluoView FV 1000 Confocal microscope | Olympus | ||
40X water-immersion lens | Olympus | LUMPLFLN40XW | |
20X water-immersion lens | Olympus | XLUMPLFL20XW | |
4X water-immersion lens | Olympus | XLFLUOR4X/340 | |
Micropipette puller | Sutter Instrument | P97 | |
Micromanipulator | Sutter Instrument | MP 225 | |
Camera CCD | Sony | CX-ST50 | |
Black and white monitor | Sony | SSM-125 | |
Digidata | Molecular devices | 1322A | |
Patch Clamp amplifier | Axon instrument | Mulitclamp 700A | |
Electrophysiology acquisition software | Molecular devices | pClamp 8 | |
Electrophysiology analysis software | Molecular devices | Clampfit 8 | |
Imaging analysis software | ImageJFIJI | Open source software. FIJI version including plug in package. | |
Vector image editor | Adobe | Illustrator CS4 | |
Spreadsheet application | Microsoft Office | Excel 2010 |