Analyseren van de grootte, de vorm en de directionaliteit van netwerken van gekoppelde astrocyten

Summary

Hier presenteren we een protocol voor de beoordeling van de organisatie van de astrocytic netwerken. De beschreven methode minimaliseert bias om beschrijvende maatregelen van deze netwerken zoals cellen, grootte, ruimte en positie binnen een kern. Anisotropie is beoordeeld met een vectoriële analyse.

Abstract

Het steeds duidelijker dat astrocyten neuronale functie niet alleen de synaptic en eencellige niveau, maar ook op netwerkniveau moduleren geworden. Astrocyten zijn sterk met elkaar verbonden via gap kruispunten en koppeling door middel van deze kruispunten is dynamisch en sterk gereguleerde. Een opkomende concept is dat astrocytic functies zijn gespecialiseerd en aangepast aan de functies van de neuronale circuit waaraan ze gekoppeld zijn. Methoden voor het meten van verschillende parameters van astrocytic netwerken zijn daarom nodig om de regels inzake hun communicatie en het koppelen van beter te beschrijven en te begrijpen verder hun functies.

Hier, met behulp van de software van de analyse van de afbeelding (bijv., ImageJFIJI), beschrijven we een methode voor het analyseren van de confocal beelden van astrocytic netwerken geopenbaard door kleurstof-koppeling. Deze methoden voldoende zijn voor de detectie van 1) een geautomatiseerde en onbevooroordeelde van gelabelde cellen, 2) de berekening van de grootte van het netwerk, 3) berekening van het preferentiële oriëntatie van kleurstof verspreiden binnen het netwerk, en 4) herpositionering van het netwerk binnen het interessegebied .

Deze analyse kan worden gebruikt voor karakteriseren astrocytic netwerken van een bepaald gebied, vergelijken van netwerken van verschillende gebieden gekoppeld aan verschillende functies of netwerken die zijn verkregen onder verschillende omstandigheden die verschillende gevolgen voor koppeling hebben vergelijken. Deze opmerkingen kunnen leiden tot belangrijke functionele overwegingen. Bijvoorbeeld, analyseren we de astrocytic netwerken van de celkern, waar we eerder hebben aangetoond dat er sprake is van essentieel belang voor het vermogen van de neuronen te schakelen hun afvuren patronen van tonic op ritmische barst¹astrocytic koppeling. Door het meten van de omvang, opsluiting en preferentiële afdrukstand van astrocytic netwerken in deze kern, kunnen we bouwen hypothesen over functionele domeinen die zij omschrijven. Meerdere studies suggereren dat verschillende andere hersengebieden, met inbegrip van het vat cortex, laterale superieure olijf-, olfactorische glomeruli, en zintuiglijke kernen in de thalamus en de visuele cortex, wat te noemen, van een soortgelijke analyse profiteren kunnen.

Introduction

Vele studies hebben beschreven hoe de neuron-Astrocyt dialoog op een sub cellulaire of synaptic niveau kan gevolgen hebben in neuronale functies en synaptische transmissie. Het is reeds lang gevestigd dat de astrocyten gevoelig zijn aan het omringen van neuronale activiteit; in feite, hebben ze receptoren voor vele neurotransmitters, met inbegrip van glutamaat, GABA acetylcholine en ATP (zie eerder gepubliceerde beoordelingen^2,3,4). In ruil daarvoor verwerkt astrocytic ensheath synaptic elementen en invloed Neuronale activiteit beide er en extrasynaptic plaatsen door regulering van de extracellulaire Ionische homeostase en het vrijgeven van verschillende factoren of zenders zoals glutamaat, D-serine en ATP ^{5 , 6 , 7}.

Het idee dat de astrocyten ook neuronale functie op netwerkniveau kunnen moduleren is ontstaan, met bewijs dat astrocytic koppeling is ruimtelijk gereguleerd en komt met de neuronale segmentatie in gebieden gekenmerkt door een duidelijke anatomische overeen Brandcompartimentering (zoals gebieden met sensorische vertegenwoordigingen), die aangeeft dat de astrocyten zullen koppelen aan andere astrocyten dienen dezelfde functie in plaats van alleen die dicht in de buurt. In de laterale superieure olive, bijvoorbeeld, zijn meest astrocytic netwerken gericht orthogonaal op de tonotopic as⁸, overwegende dat communicatie tussen de astrocyten in het vat cortex of olfactoty glomeruli, veel sterker in vaten of glomeruli en zwakker tussen aangrenzende degenen^9,10. In beide gevallen zijn de astrocytic netwerken gericht op het midden van de glomerule of vat^9,10.

We onlangs bleek dat de astrocytic activiteit neuronale afvuren moduleert door het verlagen van de concentratie van extracellulaire Ca^{2 +} ([Ca^{2 +}]_e), vermoedelijk door de vrijlating van S100β, een Ca^{2 +}-bindende eiwit¹¹. Dit effect, die werd aangetoond in een populatie van de rhythmogenic neuronen in het dorsale deel van de de belangrijkste zintuiglijke nucleus (NVsnpr, dacht dat een belangrijke rol in de generatie van Triggerpunten bewegingen), het gevolg van het feit dat ritmische afvuren in deze neuronen is afhankelijk van een persistent nb⁺ huidige die wordt bevorderd door afname van [Ca^{2 +}]_e^11,12. Ritmische afvuren in deze neuronen kan “fysiologisch” ontlokte worden door stimulatie van hun ingangen of kunstmatige verlaging van [Ca^{2 +}]_e. We verder bleek dat astrocytic koppeling vereist voor neuronale ritmische vuren¹. Dit gewag gemaakt van de mogelijkheid dat astrocytic netwerken omgeschreven functionele domeinen waar Neuronale activiteit kan worden gesynchroniseerd en gecoördineerd kunnen vormen. Om te beoordelen deze hypothese, moesten we eerst het ontwikkelen van een methode om te rigoureus het documenteren van de organisatie van deze netwerken binnen NVsnpr.

Eerdere studies op astrocytic netwerken hebben meestal de omvang van de koppeling in termen van aantal cellen en de dichtheid en het verdragsgebied beschreven. Pogingen om de vorm van astrocytic netwerken en de richting van kleurstof-koppeling te evalueren werden vooral uitgevoerd door vergelijking van de grootte van de netwerken langs twee assen (x en y) in het vat cortex⁹, hippocampus^{13,14, 15}, barreloid velden van de thalamus¹⁶, laterale superieure olijf⁸, olfactorische glomeruli¹⁰en cortex¹⁴. De hier beschreven methoden inschakelen onbevooroordeelde graven van gelabelde cellen in een netwerk en een schatting van het terrein dat ze bestrijken. We ook ontwikkeld instrumenten de voorkeur richting van koppeling binnen een netwerk te definiëren en te beoordelen of de gewenste afdrukstand naar het centrum van de kern of in een andere richting is. In vergelijking met de eerder gebruikte methoden biedt dit protocol een manier om te beschrijven van de organisatie en de oriëntatie van de astrocytic netwerken in structuren zoals de dorsale trigeminal belangrijkste zintuiglijke kern die nog geen een duidelijke anatomische bekend overheidsdepartementen. In de bovenstaande studies, de oriëntatie van het netwerk wordt beschreven als een relatie aan de vorm van de structuur zelf, die is al gedocumenteerd (bv., de barreloid in de thalamus, vaten in de cortex, lagen in de hippocampus en de cortex, de glomeruli in de bulbus olfactorius, enz.). Daarnaast voorziet het vectoriële analyse vergelijkingen oriëntaties onthuld onder verschillende omstandigheden te koppelen. Als u wilt analyseren of deze parameters gewijzigd volgens het standpunt van het netwerk binnen de kern, ontwikkelden we ook een methode ter vervanging van elk netwerk met betrekking tot de grenzen van de kern. Deze hulpprogramma’s kunnen gemakkelijk worden aangepast aan andere gebieden voor behandelende netwerken van gekoppelde cellen.

Protocol

Alle procedures door de Canadese instituten van gezondheidsonderzoek regels abode en door de Universiteit van Montreal dierenverzorgers en gebruik Comité zijn goedgekeurd. 1. voorbereiding van de Rat hersenen segmenten Bereiden 1 L van een sacharose gebaseerde oplossing (tabel 1) en 1 L voor standaard kunstmatige cerebrale-spinal fluid (aCSF) (tabel 2). Bubble de sacharose gebaseerde oplossing met een mengeling van 95% O2 en 5% …

Representative Results

Koppeling tussen de cellen in de hersenen is niet statisch maar veeleer dynamisch gereguleerd door vele factoren. De beschreven methoden werden ontwikkeld astrocytic netwerken onthuld onder verschillende omstandigheden analyseren en begrijpen van hun organisatie in NVsnpr. Deze resultaten zijn reeds gepubliceerd1. We biocytin vullen van enkele astrocyten in het dorsale deel van de NVsnpr in drie verschillende omstandigheden uitgevoerd: in rust (in controlevoorwaard…

Discussion

Er bestaan een aantal elektrofysiologische methoden voor de beoordeling van functionele koppeling tussen astrocyten^23,24. Deze methoden geven echter geen informatie over de anatomische indeling van de astrocytic netwerken. Een aantal studies hebben reeds aangetoond dat “kleurstof – of tracer-koppeling”, zoals gedaan hier, alleen op in een fractie van combinatie van cellen die zijn gedetecteerd door elektrofysiologische methoden^25,</su…

Materials

NaCl	Fisher Chemicals	S671-3
KCl	Fisher Chemicals	P217-500
KH2PO4	Fisher Chemicals	P285-500
MgSO4	Fisher Chemicals	M65-500
NaHCO3	Fisher Chemicals	S233-500
C6H12O6 Dextrose anhydrous	Fisher Chemicals	D16-500
CaCl2 dihydrated	Sigma	C70-500
Sucrose	Sigma	S9378
D-gluconic acid potassium salt	Sigma	G45001
MgCl2 anhydrous	Sigma	M8266
HEPES	Sigma	H3375
EGTA	Sigma	E4378
ATPTris Salt	Sigma	A9062
GTPTris Salt	Sigma	G9002
Biocytin	Sigma	B4261
Carbenoxolone disodium salt	Sigma	C4790
avidin-biotin complex : ABC kit	Vestor laboratories	PK-4000
Streptavidine-alexa 594	Molecular Probes	S11227
Triton	Fisher Chemicals	BP151-500
Xylene	Fisher Chemicals	X5-1
Aqueous mounting medium 1 : Fluoromount-G	SouthernBiotech	0100-01
Toluen-based synthetic resin mounting medium : Permount	Fisher Chemicals	SP15-100
Slide Drying Bench	Fisherbrand	11-474-470
Vibratome	Leica	VT 1000S
Microscope cover glass	Fisherbrand	12-544A
Microscope slide ColorFrost	Fisherbrand	12-550-413
PFA	Fisherchemicals	04042-500
Olympus FluoView FV 1000 Confocal microscope	Olympus
40X water-immersion lens	Olympus	LUMPLFLN40XW
20X water-immersion lens	Olympus	XLUMPLFL20XW
4X water-immersion lens	Olympus	XLFLUOR4X/340
Micropipette puller	Sutter Instrument	P97
Micromanipulator	Sutter Instrument	MP 225
Camera CCD	Sony	CX-ST50
Black and white monitor	Sony	SSM-125
Digidata	Molecular devices	1322A
Patch Clamp amplifier	Axon instrument	Mulitclamp 700A
Electrophysiology acquisition software	Molecular devices	pClamp 8
Electrophysiology analysis software	Molecular devices	Clampfit 8
Imaging analysis software	ImageJFIJI	Open source software. FIJI version including plug in package.
Vector image editor	Adobe	Illustrator CS4
Spreadsheet application	Microsoft Office	Excel 2010