Analizar el tamaño, forma y direccionalidad de las redes de astrocitos acoplados
Summary
Aquí presentamos un protocolo para evaluar la organización de redes astrocytic. El método descrito minimiza el sesgo para proporcionar medidas descriptivas de estas redes como recuento de células, el tamaño, zona y posición dentro de un núcleo. Anisotropía es evaluada con un análisis vectorial.
Abstract
Se ha vuelto cada vez más claro que los astrocitos modulan la función neuronal a nivel sináptico y unicelulares, sino también en el nivel de red. Los astrocitos están fuertemente conectados entre sí mediante uniones comunicantes y acoplamiento a través de estas uniones es dinámica y altamente regulada. Un concepto emergente es que funciones astrocíticos son especializadas y adaptadas a las funciones del circuito neuronal que se asocian. Por lo tanto, se necesitan métodos para medir diversos parámetros de redes astrocytic mejor describir las reglas que rigen la comunicación y el acoplamiento y entiendo sus funciones.
Aquí, usando el software de análisis de imagen (por ej., ImageJFIJI), se describe un método para analizar imágenes confocales de redes astrocytic reveladas por el acoplador de tinte. Estos métodos permiten 1) una detección automatizada y objetiva de las células marcadas, 2) cálculo del tamaño de la red, 3) cálculo de la orientación preferencial de tinte extendido dentro de la red y 4) reposición de la red dentro del área de interés .
Este análisis puede usarse para caracterizar astrocytic redes de un área en particular, comparar redes de diferentes áreas asociadas a diferentes funciones o comparar redes obtenidas en condiciones diferentes que tienen diferentes efectos en el acoplamiento. Estas observaciones pueden llevar a consideraciones funcionales importantes. Por ejemplo, se analizan las redes astrocíticos de un núcleo del trigémino, donde previamente hemos demostrado que acoplamiento astrocytic es esencial para la capacidad de las neuronas cambiar sus patrones de disparo de tónica a estallido rítmico1. Midiendo el tamaño, el parto y la orientación preferencial de redes astrocytic en este núcleo, podemos construir hipótesis sobre dominios funcionales que circunscriben. Varios estudios sugieren que varias otras áreas del cerebro, incluyendo corteza de barril, oliva superior lateral, glomérulos olfativos los núcleos sensoriales en el tálamo y la corteza visual, por nombrar algunos, pueden beneficiarse de un análisis similar.
Introduction
Muchos estudios han descrito cómo el diálogo astrositos neurona a nivel subcelular o sináptico puede tener implicaciones en las funciones neuronales y transmisión sináptica. Está bien establecido que los astrocitos son sensibles a los que rodean la actividad neuronal; de hecho, tienen receptores para muchos neurotransmisores como glutamato, GABA, acetilcolina y ATP (ver comentarios anteriormente publicados2,3,4). A cambio, astrocytic procesos elementos sinápticas ensheath y actividad neuronal influencia allí y en los sitios extrasinápticos regulación de la homeostasis iónica extracelular y soltando varios factores o transmisores tales como glutamato, D-serina y ATP 5 , 6 , 7.
Ha surgido la idea de que los astrocitos también pueden modular la función neuronal a nivel de red, con pruebas de que astrocytic acoplamiento espacial está regulada y corresponde a la segmentación neuronal en áreas caracterizadas por un claro anatómica compartimentalización (como zonas con representaciones sensoriales), indicando que los astrocitos se pareja otros astrocitos que sirven la misma función en lugar de sólo los que están cerca. En la oliva superior lateral, por ejemplo, redes más astrocíticos se orientan ortogonalmente al eje tonotópica8, mientras que en los glomérulos de corteza o olfactoty de barril, comunicación entre astrocitos es mucho más fuerte dentro de barriles o glomérulos y más débil entre los adyacentes unos9,10. En ambos casos, las redes astrocíticos se orientan hacia el centro de la glomerule o barril9,10.
Recientemente demostramos que actividad astrocytic modula la leña neuronal por la disminución de la concentración extracelular Ca2 + ([Ca2 +]e), presumiblemente a través de la liberación de S100β, Ca2 +-binding proteína11. Este efecto, que fue demostrado en una población de neuronas rhythmogenic del trigémino en la parte dorsal del sensorial principal del trigémino núcleo (NVsnpr, se cree que juegan un papel importante en la generación de movimientos de masticación), resulta del hecho de que rítmico disparo de estas neuronas depende de una persistente Na+ actual que es promovida por disminuciones de [Ca2 +]e11,12. Rítmico disparo de estas neuronas puede sacaron “fisiológico” por el estímulo de sus entradas o disminución artificial de la [Ca2 +]e. Demostramos más que acoplamiento astrocytic fue requerida para leña rítmica neuronal1. Esto levantó la posibilidad de que redes astrocytic pueden formar dominios funcionales circunscritos donde la actividad neuronal puede ser sincronizada y coordinada. Para evaluar esta hipótesis, primero teníamos que desarrollar un método para documentar rigurosamente la organización de estas redes en NVsnpr.
Estudios previos en redes astrocytic han descrito sobre todo el grado de acoplamiento en términos de número de la célula y la densidad y área cubierta. Tentativas para evaluar la forma de redes astrocytic y la dirección de acoplamiento de tinte en su mayoría fueron realizadas comparando el tamaño de las redes a lo largo de dos ejes (x e y) en el barril corteza9, hipocampo13,14, 15, barreloid campos del tálamo16, oliva superior lateral8, glomérulos olfativos10y14de la corteza. Los métodos aquí descritos permiten imparciales recuentos de células marcadas en una red y una estimación del área que cubren. También hemos desarrollado herramientas para definir la orientación preferida de acoplamiento dentro de una red y evaluar si la orientación preferida es hacia el centro del núcleo o en una dirección diferente. En comparación con los métodos utilizados anteriormente, este protocolo proporciona un medio para describir la organización y orientación de astrocytic redes en estructuras como el núcleo sensorial principal del trigémino dorsal que no tienen una clara anatómica conocida compartimentalización. En los estudios mencionados, la orientación de la red se describe como una relación a la forma de la estructura que ya está documentada (por ej., la barreloid en el tálamo, barriles en la corteza, las capas en el hipocampo y corteza, glomérulos en el bulbo olfatorio, etcetera). Además, análisis vectorial permite comparaciones de orientaciones reveladas bajo diferentes condiciones de acoplamiento. Para analizar si estos parámetros cambiaron según la posición de la red dentro del núcleo, también se desarrolló un método para cada red en referencia a los límites del núcleo. Estas herramientas pueden ser fácilmente adaptadas a otras áreas para investigar redes de células acopladas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Existe un número de métodos electrofisiológicos para evaluar funcional acoplamiento entre astrocitos23,24. Sin embargo, estos métodos no proporcionan información sobre el arreglo anatómico astrocytic redes. Varios estudios ya han demostrado que “colorante o trazador-acoplamiento”, como aquí, se produce sólo en una fracción de junto a las células que se detectan por métodos electrofisiológicos25,26</…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo es financiado por los institutos canadienses de investigación en salud, número de subvención o premio: 14392.
Materials
| NaCl | Fisher Chemicals | S671-3 | |
| KCl | Fisher Chemicals | P217-500 | |
| KH2PO4 | Fisher Chemicals | P285-500 | |
| MgSO4 | Fisher Chemicals | M65-500 | |
| NaHCO3 | Fisher Chemicals | S233-500 | |
| C6H12O6 Dextrose anhydrous | Fisher Chemicals | D16-500 | |
| CaCl2 dihydrated | Sigma | C70-500 | |
| Sucrose | Sigma | S9378 | |
| D-gluconic acid potassium salt | Sigma | G45001 | |
| MgCl2 anhydrous | Sigma | M8266 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| EGTA | Sigma | E4378 | |
| ATPTris Salt | Sigma | A9062 | |
| GTPTris Salt | Sigma | G9002 | |
| Biocytin | Sigma | B4261 | |
| Carbenoxolone disodium salt | Sigma | C4790 | |
| avidin-biotin complex : ABC kit | Vestor laboratories | PK-4000 | |
| Streptavidine-alexa 594 | Molecular Probes | S11227 | |
| Triton | Fisher Chemicals | BP151-500 | |
| Xylene | Fisher Chemicals | X5-1 | |
| Aqueous mounting medium 1 : Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| Toluen-based synthetic resin mounting medium : Permount | Fisher Chemicals | SP15-100 | |
| Slide Drying Bench | Fisherbrand | 11-474-470 | |
| Vibratome | Leica | VT 1000S | |
| Microscope cover glass | Fisherbrand | 12-544A | |
| Microscope slide ColorFrost | Fisherbrand | 12-550-413 | |
| PFA | Fisherchemicals | 04042-500 | |
| Olympus FluoView FV 1000 Confocal microscope | Olympus | ||
| 40X water-immersion lens | Olympus | LUMPLFLN40XW | |
| 20X water-immersion lens | Olympus | XLUMPLFL20XW | |
| 4X water-immersion lens | Olympus | XLFLUOR4X/340 | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | P97 | |
| Micromanipulator | Sutter Instrument | MP 225 | |
| Camera CCD | Sony | CX-ST50 | |
| Black and white monitor | Sony | SSM-125 | |
| Digidata | Molecular devices | 1322A | |
| Patch Clamp amplifier | Axon instrument | Mulitclamp 700A | |
| Electrophysiology acquisition software | Molecular devices | pClamp 8 | |
| Electrophysiology analysis software | Molecular devices | Clampfit 8 | |
| Imaging analysis software | ImageJFIJI | Open source software. FIJI version including plug in package. | |
| Vector image editor | Adobe | Illustrator CS4 | |
| Spreadsheet application | Microsoft Office | Excel 2010 |
References
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