כאן אנו מציגים פרוטוקול כדי להעריך את הארגון של רשתות astrocytic. השיטה המתוארת ממזער הטיה לספק מדדים תיאוריים של רשתות אלה כגון ספירת תאים, גודל, שטח, מיקום בתוך גרעין. . בנוגע למקורו שקובעת עם ניתוח וקטורי.
זה הפך ליותר ויותר ברורה האסטרוציטים לווסת את תפקוד לא רק ברמות סינפטית, תא בודד, אלא גם ברמת הרשת. האסטרוציטים חריפה מחוברים אחד לשני דרך צמתי הפער והוא צימוד דרך יפלו דינמי ומוסדרת מאוד. קונספט המתעוררים הוא פונקציות astrocytic מיוחדים ומותאמים לפונקציות של מעגל עצביים שאליו הן משויכות. לכן, שיטות למדידת פרמטרים שונים של רשתות astrocytic נחוצים יותר לתאר את הכללים המסדירים את התקשורת שלהם, מצמד, להבין עוד יותר את הפונקציות שלהם.
כאן, שימוש בתוכנת ניתוח התמונה (למשל., ImageJFIJI), אנו מתארים שיטה לניתוח תמונות קונאפוקלית של רשתות astrocytic חשף זיווגו-צבע. שיטות אלה מאפשרים 1) האוטומטי לא משוחד זיהוי, של תאים עם תוויות, 2) חישוב של הגודל של הרשת, 3) חישוב כיוון מועדף של צבע להתפשט בתוך הרשת, ההגדלה והמיקום 4) של הרשת בתוך האזור בעל עניין .
ניתוח זה יכול לשמש כדי לאפיין את רשתות astrocytic של אזור מסויים, להשוות רשתות של אזורים שונים הקשורים לפונקציות שונות או להשוות רשתות שהושגו בתנאים שונים כי יש השפעות שונות על צימוד. תצפיות אלה עלולה להוביל חשוב בשיקולים פונקציונליים. למשל, אנחנו מנתחים את הרשתות astrocytic של גרעין טריגמינל, איפה אנחנו בעבר הראו כי צימוד astrocytic הוא חיוני עבור היכולת של נוירונים לעבור על דפוסי הירי של טוניק המתפרצת קצבית1. על ידי מדידת את גודל, כליאה, וכיוון מועדף של רשתות astrocytic בגרעין הזה, נוכל לבנות השערות לגבי התחומים הפונקציונליים הם circumscribe. מספר מחקרים מראים כי מספר המוח בתחומים אחרים, כולל חבית, זית מעולה לרוחב, חוש הריח glomeruli ולשגר את הגרעינים חושית תלמוס, קליפת הראייה, שם כמה, עשויה להועיל ניתוח דומה.
מחקרים רבים תיארו איך הדיאלוג נוירון-אסטרוציט ברמה התאית תת או סינפטית יכול להיות השלכות פונקציות עצביים, העברה סינפטית. היא מבוססת היטב כי האסטרוציטים רגישים סביב פעילות. עצבית; למעשה, יש להם רצפטורים של נוירוטרנסמיטורים רבים כולל גלוטמט, גאבא, אצטילכולין ו- ATP (ראה הדעת שפורסמו בעבר-2,–3,–4). בתמורה, astrocytic תהליכים אלמנטים סינפטית ensheath וגם פעילות. עצבית השפעה, באתרים extrasynaptic על ידי ויסות הומאוסטזיס יוניים חוץ-תאית ושחרור מספר גורמים או משדרי כגון גלוטמט, D-סרין ו- ATP 5 , 6 , 7.
הרעיון כי האסטרוציטים יכול גם לווסת תפקוד ברמת הרשת התפתחה, עם ראיות כי צימוד astrocytic במרחב מוסדר, מקביל פילוח העצבית באזורים מאופיין אנטומי ברור מידור (כמו אזורים עם ייצוגים חושית), המציין כי האסטרוציטים נשלים כדי אחרים האסטרוציטים המשרתים את אותה הפונקציה ולא רק על אלה נמצאים בקרבת מקום. בזית מעולה לרוחב, למשל, רשתות astrocytic ביותר הם שכיוונו orthogonally על ציר ‘ tonotopic ‘8, ואילו glomeruli קליפת או olfactoty חבית, תקשורת בין האסטרוציטים הוא הרבה יותר חזק בתוך חביות או glomeruli חלש יותר בין סמוכים אלה9,10. בשני המקרים, הרשתות astrocytic הם שכיוונו לכיוון מרכז ה glomerule או חבית9,10.
לאחרונה הראינו כי פעילות astrocytic ממיקרו עצביים ירי על ידי הפחתת הריכוז של Ca חוץ-תאית2 + ([Ca2 +]e), ככל הנראה דרך שחרורו של S100β, Ca2 +-איגוד חלבון11. את האפקט הזה, שבו הודגם על אוכלוסיה של rhythmogenic טריגמינל נוירונים בחלק הגבי של חושי הראשי טריגמינל גרעין (NVsnpr, חשב לשחק תפקיד חשוב דור של תנועות masticatory), נובעת מהעובדה כי ירי קצבית בנוירונים אלו תלוי עקשן Na+ הנוכחי זה מקודם על ידי ירידות של [Ca2 +]e11,12. ירי קצבית בנוירונים אלו יכולים להיות שהפיק “. פיזיולוגית” גירוי של תשומות שלהם או ירידה מלאכותית של [Ca2 +]e. בהמשך הראינו כי צימוד astrocytic היה נדרש עבור ירי קצבית עצביים1. זה העלה את האפשרות כי רשתות astrocytic עלולה להיווצר חוסם תחומים פונקציונליים בו פעילות. עצבית יכול להיות מסונכרנת ומתואמת. כדי להעריך את השערה זו, נזקקנו קודם לפתח שיטה לתעד בקפדנות את הארגון של רשתות אלה בתוך NVsnpr.
מחקרים קודמים ברשתות astrocytic תיארו בעיקר את מידת צימוד מבחינת מספר הטלפון הנייד ואת צפיפות אזור מכוסה. ניסיונות כדי להעריך את הצורה של רשתות astrocytic ואת הכיוון של צבע-מצמד בוצעו בעיקר על-ידי השוואת גודל רשתות לאורך שני צירים (x ו- y) ב חבית קליפת9, ההיפוקמפוס13,14, 15, barreloid שדות של התלמוס16, לרוחב זית מעולה8, חוש הריח glomeruli10, קליפת14. בשיטות המתוארות כאן מאפשרים עבירות לא משוחדת של תאים עם תוויות ברשת הערכה של האזור שהם מכסים. פיתחנו גם כלים כדי להגדיר את הכיוון המועדף של צימוד בתוך רשת וכדי להעריך אם הכיוון המועדף הוא לכיוון המרכז של הגרעין או בכיוון אחר. לעומת שיטות השתמשו בעבר, פרוטוקול זה מספק אמצעים כדי לתאר את הארגון ואת כיוון ההדפסה של רשתות astrocytic במבנים כמו הגבי טריגמינל גרעין החישה העיקריים שאין ידוע אנטומי ברור מידור. במחקרים לעיל, כיוון רשת מתואר יחסים לפי צורת המבנה עצמו אשר מתועדת כבר (למשל., barreloid של התלמוס, חביות בקליפת, שכבות ההיפוקמפוס, קליפת המוח, glomeruli ב הריח הנורה, וכו ‘). בנוסף, מאפשרת ניתוח וקטורי להשוואות מצמד אוריינטציות חשף בתנאים שונים. כדי לנתח אם פרמטרים אלה משתנה בהתאם למיקום של הרשת בתוך הגרעין, גם פיתחנו שיטה כדי להחליף את כל רשת ביחס לגבולות של הגרעין. כלים אלה ניתן להתאים בקלות לאזורים אחרים לרשתות החקירה של תאים בשילוב.
קיימות מספר שיטות אלקטרופיזיולוגיות להערכת תפקודי צימוד בין האסטרוציטים23,24. עם זאת, שיטות אלה אינם מספקים מידע אודות הסידור האנטומי של רשתות astrocytic. מספר מחקרים הראו כבר כי “צבע – או מעקב-מצמד”, כפי שנעשה כאן, מתרחשת רק בשבריר של מצמידים תאים שזוהו על-ידי שיטות…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו ממומנת על ידי קנדי מוסדות של בריאות המחקר, גרנט/פרס המספר: 14392.
NaCl | Fisher Chemicals | S671-3 | |
KCl | Fisher Chemicals | P217-500 | |
KH2PO4 | Fisher Chemicals | P285-500 | |
MgSO4 | Fisher Chemicals | M65-500 | |
NaHCO3 | Fisher Chemicals | S233-500 | |
C6H12O6 Dextrose anhydrous | Fisher Chemicals | D16-500 | |
CaCl2 dihydrated | Sigma | C70-500 | |
Sucrose | Sigma | S9378 | |
D-gluconic acid potassium salt | Sigma | G45001 | |
MgCl2 anhydrous | Sigma | M8266 | |
HEPES | Sigma | H3375 | |
EGTA | Sigma | E4378 | |
ATPTris Salt | Sigma | A9062 | |
GTPTris Salt | Sigma | G9002 | |
Biocytin | Sigma | B4261 | |
Carbenoxolone disodium salt | Sigma | C4790 | |
avidin-biotin complex : ABC kit | Vestor laboratories | PK-4000 | |
Streptavidine-alexa 594 | Molecular Probes | S11227 | |
Triton | Fisher Chemicals | BP151-500 | |
Xylene | Fisher Chemicals | X5-1 | |
Aqueous mounting medium 1 : Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
Toluen-based synthetic resin mounting medium : Permount | Fisher Chemicals | SP15-100 | |
Slide Drying Bench | Fisherbrand | 11-474-470 | |
Vibratome | Leica | VT 1000S | |
Microscope cover glass | Fisherbrand | 12-544A | |
Microscope slide ColorFrost | Fisherbrand | 12-550-413 | |
PFA | Fisherchemicals | 04042-500 | |
Olympus FluoView FV 1000 Confocal microscope | Olympus | ||
40X water-immersion lens | Olympus | LUMPLFLN40XW | |
20X water-immersion lens | Olympus | XLUMPLFL20XW | |
4X water-immersion lens | Olympus | XLFLUOR4X/340 | |
Micropipette puller | Sutter Instrument | P97 | |
Micromanipulator | Sutter Instrument | MP 225 | |
Camera CCD | Sony | CX-ST50 | |
Black and white monitor | Sony | SSM-125 | |
Digidata | Molecular devices | 1322A | |
Patch Clamp amplifier | Axon instrument | Mulitclamp 700A | |
Electrophysiology acquisition software | Molecular devices | pClamp 8 | |
Electrophysiology analysis software | Molecular devices | Clampfit 8 | |
Imaging analysis software | ImageJFIJI | Open source software. FIJI version including plug in package. | |
Vector image editor | Adobe | Illustrator CS4 | |
Spreadsheet application | Microsoft Office | Excel 2010 |