Kvantificering af Efferocytosis af encellede Fluorescens mikroskopi

Summary

Efferocytosis, fagocyterende fjernelse af apoptotiske celler, er forpligtet til at opretholde homøostase og lettes ved receptorer og signalering veje, der giver mulighed for anerkendelse, engulfment og internalisering af apoptotiske celler. Heri, præsenterer vi en Fluorescens mikroskopi protokol til kvantificering af efferocytosis og aktivitet af efferocytic signaling veje.

Abstract

At studere regulering af efferocytosis kræver metoder, der kunne nøjagtigt kvantificere optagelsen af apoptotiske celler og sonde til signalering og cellulære processer, der styrer efferocytosis. Denne kvantificering kan være vanskelige at udføre som apoptotiske celler er ofte efferocytosed stykkevis, således nødvendiggør metoder, der kan præcist afgrænse mellem efferocytosed del af et apoptotiske mål versus resterende unengulfed cellular fragmenter. Den metode beskrevet heri udnytter dual-mærkning tilgange for at nøjagtigt kvantificere dynamikken i efferocytosis og efferocytic kapacitet af efferocytes såsom makrofager. Cytosol af cellen apoptotiske er mærket med en celle-tracking farvestof til at aktivere overvågning af alle apoptotiske celle-afledte materialer, mens overflade biotinylation af cellen apoptotiske giver mulighed for differentiering mellem internaliseret og ikke internaliseret apoptotiske celle fraktioner. Efferocytic kapaciteten af efferocytes bestemmes ved at tage fluorescerende billeder af levende eller faste celler og kvantificere mængden af bundne versus internaliseret mål, differentieret ved streptavidin farvning. Denne tilgang giver flere fordele over metoder såsom flowcytometri, nemlig den nøjagtige afgrænsning af efferocytosed versus efferocytosed apoptotiske celle fraktioner, evnen til at måle efferocytic dynamics af live-celle mikroskopi, og den kapacitet til at udføre undersøgelser af cellulær signalering i celler, der udtrykker fluorescently mærket transgener. Kombineret, tjene de metoder, der er skitseret i denne protokol som grundlag for en fleksibel eksperimenterende tilgang, der kan bruges til at nøjagtigt kvantificere efferocytic aktivitet og afhøre cellulær signalering veje aktive under efferocytosis.

Introduction

Apoptose, eller programmeret celledød er en stærkt reguleret fysiologisk proces, der forekommer i de fleste flercellede organismer og er afgørende for deres udvikling og homøostase¹. Ud over at være involveret i normal cellefornyelsen og fosterudviklingen, apoptose giver mulighed for fjernelse af inficerede eller beskadiget celler fra væv og kan udløses i reaktion på infektion, inflammation, kræft, og også af lægelige indgreb såsom strålebehandling eller steroider¹. Apoptotiske celler udsætte “spise-mig” signaler på deres celleoverfladen, som er anerkendt af receptorer på en vifte af professionelle og ikke-professionelle fagocytter, kollektivt benævnt “efferocytes”. Engagement i disse receptorer inducerer optagelse og nedbrydning af cellen apoptotiske af efferocyte gennem en proces kendt som efferocytosis^2,3. Fosfatidylserin er bedst karakteriseret spise-mig signal drivende efferocytosis. Det er normalt begrænset til den indre folder af plasma membran, med apoptose aktivering en lipid-scramblase, som forstyrrer denne membran asymmetri, dermed udsætte phosphatidylserin på celle overflade⁴. Fosfatidylserin er fundet på den ekstracellulære overfladen af nogle ikke-apoptotiske celler, såsom modne makrofager og aktiveret blodplader. Disse celler er imidlertid ikke efferocytosed på grund af tilstedeværelsen af “ikke spise mig” signaler, såsom CD47, på deres celle overfladen^5,6,7. Udsatte phosphatidylserin genkendes af en bred vifte af efferocytic receptorer udtrykt ved efferocytes. Binding af disse receptorer til phosphatidylserin, aktiveres enten direkte eller gennem støtte af opsonins, signaling veje, der fremmer engulfment af cellen apoptotiske i en membran-bundet vacuole betegnes efferosome^{8, 9 , 10 , 11 , 12}. efferosome sikringer sekventielt med endosomes og lysosomer, som leverer de molekylære maskineri for at forsure efferosome og forringe apoptotiske celle cargo^13,14. Når nedbrudt, apoptotiske celle-afledte materialer der handles til genanvendelse endosome — en proces, der begrænser immunrespons mod apoptotiske celle-afledte antigener, og som kan give mulighed for genvinding af næringsstoffer fra apoptotiske celle^{13, 15}. En fejl i efferocytosis medfører nedsat clearance af apoptotiske celler; disse uncleared celler underkastes i sidste ende sekundær nekrose. Nekrotiske celler frigive pro-inflammatoriske cytosole indholdet, patogener og autoantigens i det ekstracellulære miljø, således køre en række infektiøse, inflammatoriske og autoimmune sygdomme^16,17. Sammen, apoptose og efferocytosis lette fjernelsen af døende og døde celler og giver mulighed for vedligeholdelsen af væv homøostase.

Undersøger de underliggende efferocytosis molekylære mekanismer kræver metoder, der giver en klar kvantificering af apoptotiske celle optagelse. Denne kvantificering kompliceres af det faktum, at i modsætning til andre optagelse mekanismer såsom endocytose og fagocytose^18,19, efferocytosis ikke kan resultere i engulfment af intakt målcellen, resulterer i den stykkevise optagelse af cellen apoptotiske efferocyte²⁰. Protokollen beskrevet heri beskriver en i vitro efferocytosis analyse der giver præcise afgrænsning af den internaliseret versus ikke-internaliseret dele af individuelle apoptotiske celler og kan være kombineret med en række faste celle og Live-celle mikroskopi metoder. Traditionelle fagocytose assays tilføje antistoffer specifikke for fagocyterende målet i slutningen af forsøget for at mærke ikke internaliseret mål, hvor det som vores metode adskiller sig ved mærkning apoptotiske målet med kovalent knyttet biotin^{21 , 22}. mens apoptotiske celle specifikke antistoffer kan bruges i denne analyse, biotinylation tilgangen giver mulighed for enhver protein-bærende mål skal være mærket og undgår potentielle problemer med sekundær antistof krydsreaktivitet hvis immunfarvning udføres . Specifikt, skitsere vi forberedelse af apoptotiske Jurkat celler, der har været dual-farves med både en celle tracking farvestof og biotin. Cellen tracking farvestof giver mulighed for apoptotiske celle-afledte materialer skal være spores under efferocytosis, paa overfladen biotinylation giver mulighed for forskelsbehandling af internaliseret fra ikke-internaliseret dele af efferocytosed apoptotiske celler. Vi beskriver også kultur og forberedelse af J774.2 og THP-1 cellelinjer til brug som murine og menneskelige efferocytes, monocyt-afledte M2 makrofager som et eksempel på primær celle efferocytosis og Jurkat celler til brug som efferocytic mål. Disse metoder kan let anvendes på andre cellelinjer eller primærelementer, målceller under enhver form for celledød (fx apoptose, nekrose og necroptosis) og micron mellemstore efterligner, som simulere apoptotiske celler gennem lipid belægninger eller belægning med ligander specifikke for en efferocytic receptor af interesse.

Den metode, der er skitseret i denne protokol har flere fordele i forhold til flow flowcytometri baseret metoder almindeligvis anvendes i feltet^23,24. Ved direkte imaging phagocyt-apoptotiske celle interaktion, kombineret med tydelig mærkning af både samlede og ikke internaliseret apoptotiske cellestof, kan kvantitative foranstaltninger af efferocytosis gøres. Desuden begrænser brugen af pH-ufølsom fluorophores konfunderende faktorer såsom undertrykkelsen af FITC og normal god landbrugspraksis fluorescens på lysosomale pH, der tilintetgør nogle alternative metoder²⁵. Endelig, mens ikke beskrevet i detaljer, disse metoder kan være ansat ved hjælp af efferocytes at udtrykke fluorescently mærket transgener, eller med efter fiksering immunfarvning, at give mulighed for kvantificering af signalering molekyle aktivitet og overvågning af de cellulære processer under efferocytosis.

Protocol

Samling af blod fra raske frivillige forsøgspersoner blev godkendt af Health Science forskning etik Board af University of Western Ontario. Venepunktur blev udført i overensstemmelse med retningslinjerne i Tri-Rådets politik redegørelse om menneskelige forskning. 1. kultur og forberedelse af THP-1 monocyt cellelinie Kultur THP-1 monocytter som en suspension kultur i T25 kolber på 37 ° C + 5% CO2. Celler skal være dyrket i 5 mL af Roswell Park Memorial Institute 1640…

Representative Results

Natten kultur af Jurkat celler med 1 µM staurosporine resultater i apoptose af > 95% af celler, der kan bekræftes med Annexin V farvning (figur 1). Andre celletyper kan anvendes til disse forsøg, selvom koncentrationen af staurosporine og staurosporine behandlingens varighed skal være optimeret til hver cellelinje. For pålidelig påvisning og kvantificering af efferocytosis, > 80% af celler skal være apoptotiske forud for at føje dem til efferocytes. A…

Discussion

De metoder, der er skitseret i denne protokol aktiverer imaging og kvantificering af dynamiske efferocytic processen, brug af både fast-celle og live-celle tilgange. Disse tilgange giver flere fordele sammenlignet med almindeligt ansat flow flowcytometri-baserede metoder^23,24. Brugen af inside-out farvning med faste prøver giver en mere robust og nøjagtig kvantificering af hastigheden og omfanget af efferocytosis — ja, mange flow flowcytometri-baserede metod…

Materials

RPMI 1640 Media	Wisent	3500-000-EL
DMEM Media	Wisent	319-005-CL
Fetal Bovine Serum (FBS)	Wisent	080-150
PBS	Wisent	311-010-CL
18 mm circular glass coverslips #1.5 thickness	Electron Microscopy Sciences	72290-08	Size and shape of coverslip is not critical, but 18 mm fit into the wells of a standard 12-well plate which simplifies cell culture
Staurosporine	Cayman Chemical	81590	Dissolve in DMSO at 1 mM (1,000x stock solution)
Annexin V-Alexa 488	ThermoFisher	R37174
EZ-Link NHS-Biotin	ThermoFisher	20217	Store in a dessicator. Do not prepare a stock solution.
DMSO	Sigma-Aldrich	D2650
CellTrace FarRed	ThermoFisher	C34572
CellTrace Orange	ThermoFisher	C34851
Hoescht 33342	ThermoFisher	62249
FITC-Streptavadin	ThermoFisher	SA1001
Lympholyte-poly cell sepration medium	Cedarlane Labs	CL5071
Recombinant Human M-CSF	Peprotech	200-04
Recombinant Human IL-4	Peprotech	300-25
J774.2 Macrophage Cell Line	Sigma-Aldrich	85011428-1VL
THP-1 Human Monocyte Cell Line	ATCC	TIB-202
Jurkat T Cell Line	ATCC	TIB-152