التحديد الكمي افيروسيتوسيس بالفحص المجهري Fluorescence خلية واحدة
Summary
مطلوب للحفاظ على التوازن افيروسيتوسيس، إزالة متجولة للخلايا أبوبتوتيك، ويسر مستقبلات ومسارات الإشارات التي تسمح للاعتراف، والإحاطة، واستيعاب الخلايا أبوبتوتيك. وهنا، نقدم بروتوكول الفحص المجهري الأسفار لتقدير افيروسيتوسيس ونشاط مسارات إشارات افيروسيتيك.
Abstract
دراسة تنظيم افيروسيتوسيس يتطلب وسائل تكون قادرة على دقة قياس امتصاص الخلايا أبوبتوتيك والتحقيق في عمليات إرسال الإشارات والخلوية التي تتحكم في افيروسيتوسيس. هذا التحديد الكمي يمكن أن يكون صعباً للقيام على النحو apoptotic الخلايا غالباً افيروسيتوسيد مجزأة، مما يستوجب الطرق التي يمكن أن تحدد بدقة بين الجزء افيروسيتوسيد من هدف أبوبتوتيك مقابل الخلوية أونينجولفيد المتبقية الشظايا. ويستخدم النهج المبين في هذه الوثيقة نهج التسمية المزدوجة لقياس دقة ديناميات القدرات افيروسيتوسيس وافيروسيتيك من افيروسيتيس مثل الضامة. يسمى سيتوسول الخلية أبوبتوتيك بصبغة خلية تتبع لتمكينها من رصد جميع المواد apoptotic المستمدة من الخلية، بينما بيوتينيليشن سطح الخلية apoptotic يسمح بالتمييز بين المدخلة وغير مستوعبة أبوبتوتيك خلية الكسور. يتم تحديد قدرة افيروسيتيك افيروسيتيس بأخذ الصور الفلورية للخلايا الحية أو ثابتة والتحديد الكمي لمقدار منضم مقابل الأهداف المدخلة، كما ميزت تلطيخ streptavidin. هذا النهج يوفر العديد من المزايا على أساليب مثل التدفق الخلوي، هما ترسيم دقيق من غير افيروسيتوسيد مقابل افيروسيتوسيد أبوبتوتيك خلية الكسور، القدرة على قياس ديناميات افيروسيتيك بالفحص المجهري خلية يعيش، القدرة على إجراء دراسات للإشارات الخلوية في الخلايا معربا عن المتسلسلات المسمى فلوريسسينتلي. جنبا إلى جنب، الأساليب المذكورة في هذا البروتوكول بمثابة الأساس لنهج مرن تجريبية التي يمكن استخدامها لدقة قياس النشاط افيروسيتيك واستجواب مسارات الإشارات الخلوية النشطة أثناء افيروسيتوسيس.
Introduction
المبرمج، أو موت الخلية المبرمج، هو الغاية-وينظم عملية فسيولوجية التي تحدث في معظم الكائنات الحية متعددة الخلايا، وهو أمر حاسم ل التنمية والتوازن على1. بالإضافة إلى اشتراكها في دوران الخلية الطبيعية والتنمية الجنينية، المبرمج يمكن القضاء على الخلايا المصابة أو التالف من الأنسجة ويمكن أن تسبب استجابة للعدوى، والتهاب، والسرطان، وأيضا بالتدخلات الطبية مثل العلاج بالأشعة أو المنشطات1. الكشف عن الخلايا أبوبتوتيك “أكل-لي” إشارات على سطحها الخلية التي تعترف بها مستقبلات على طائفة من البالعات المهنية وغير المهنية، يشار إليها باسم “افيروسيتيس”. مشاركة هذه المستقبلات الحث على الإقبال وتدهور الخلية أبوبتوتيك التي افيروسيتي من خلال عملية تعرف باسم افيروسيتوسيس،من23. فوسفاتيديلسيريني هو الأفضل تتسم أكل-لي إشارة افيروسيتوسيس القيادة. عادة ما تقتصر على النشرة الداخلية من غشاء البلازما، مع المبرمج تفعيل سكرامبلاسي دهن الذي يعطل هذا التفاوت الغشاء، مما يعرض فوسفاتيديلسيريني على سطح الخلية4. ويوجد على سطح بعض الخلايا غير أبوبتوتيك، مثل الضامة الناضجة خارج الخلية فوسفاتيديلسيريني وتنشيط الصفائح الدموية. ومع ذلك، ليست هذه الخلايا افيروسيتوسيد بسبب وجود إشارات “لا يأكلون لي”، مثل CD47، في تلك الخلية السطحية5،6،7. فوسفاتيديلسيريني المكشوفة المسلم من صفيف مستقبلات افيروسيتيك أعرب عن طريق افيروسيتيس. ملزم لهذه المستقبلات إلى فوسفاتيديلسيريني، أما مباشرة أو من خلال المعونة من أوبسونينس، ينشط مسارات الإشارات التي تعزز الإحاطة الخلية apoptotic إلى المنقبضة غشاء زمنياً وصف افيروسومي8، 9 , 10 , 11 , 12-افيروسومي الصمامات تسلسلياً مع اندوسوميس و lysosomes، التي توفر الآلية الجزيئية الضرورية أسيديفي في افيروسومي وتتحلل في أبوبتوتيك الخلية الشحن13،14. مجرد المتدهورة، يتم الاتجار بالمواد المستمدة من الخلايا أبوبتوتيك إلى دخلول إعادة التدوير – عملية مما يحد من الاستجابات المناعية المستضدات المشتقة من الخلايا أبوبتوتيك، والتي قد تسمح لاسترداد المواد الغذائية من خلية أبوبتوتيك13، 15. فشل في نتائج افيروسيتوسيس في إزالة البصر من الخلايا أبوبتوتيك؛ تخضع هذه الخلايا التي لم تتم إزالتها في نهاية المطاف نخر الثانوية. نخرية الخلايا الإفراج عن محتويات سيتوسوليك برو–التهابات ومسببات الأمراض، وأوتوانتيجينس في الوسط خارج الخلية، وهكذا يقود مجموعة من الأمراض المعدية والالتهابات والمناعة الذاتية16،17. معا، المبرمج وافيروسيتوسيس تيسير إزالة خلايا الموت والميت والسماح للحفاظ على التوازن الأنسجة.
يتطلب التحقيق في الآليات الجزيئية الكامنة وراء افيروسيتوسيس الأساليب التي تتيح إجراء تقييم كمي واضح لامتصاص الخلية أبوبتوتيك. هذا التحديد الكمي معقد من حقيقة أنه خلافا لامتصاص أخرى لا ينتج آليات مثل الالتقام والبلعمه،من1819، افيروسيتوسيس في الإحاطة للخلية الهدف سليمة، أدى إلى استيعاب تدريجي خلية أبوبتوتيك افيروسيتي20. البروتوكول الموضحة هنا وصف في المختبر افيروسيتوسيس مقايسة التي توفر ترسيم دقيق المدخلة مقابل عدم استيعاب أجزاء من الخلايا الفردية أبوبتوتيك ويمكن دمجها مع مجموعة متنوعة من خلايا ثابتة و النهج مجهرية تعيش الخلية. فحوصات البلعمه التقليدية إضافة أجسام مضادة محددة الهدف متجولة في نهاية هذه التجربة من أجل تسمية أهدافا غير مستوعبة، حيث أنه لدينا أسلوب يختلف عن طريق الوسم الهدف أبوبتوتيك مع البيوتين مرتبطة تساهميا21 , 22-بينما apoptotic الخلية أجسام مضادة محددة يمكن أن تستخدم في هذا التحليل، النهج بيوتينيليشن الذي يسمح لأي هدف الحاملة للبروتين يكون المسمى ويتجنب المشاكل المحتملة مع الجسم المضاد الثانوي ه إذا أجرى إيمونوستينينج . على وجه التحديد، فإننا مخطط إعداد الخلايا جوركات أبوبتوتيك التي كانت ملطخة المزدوج مع كل خلية تتبع صبغ والبيوتين. خلية تتبع صبغة يسمح للمواد المستمدة من الخلايا apoptotic تعقبها أثناء افيروسيتوسيس، بينما يسمح بيوتينيليشن السطحية للتمييز لاستيعابه من الأجزاء غير مستوعبة من الخلايا أبوبتوتيك افيروسيتوسيد. كما يصف لنا في الثقافة وإعداد خطوط الخلايا J774.2 و THP-1 للاستخدام افيروسيتيس مورين والبشرية، والمشتقة من الوحيدات الضامة M2 كمثال على افيروسيتوسيس الخلايا الأولية والخلايا جوركات لاستخدامها كأهداف افيروسيتيك. يمكن بسهولة تطبيق هذه الأساليب على خطوط الخلية أو الخلايا الأولية، إلى خلايا الهدف تمر بأي شكل من موت الخلية (مثل المبرمج ونخر نيكروبتوسيس)، وإلى يقلد ميكرون الحجم التي تحاكي apoptotic الخلايا عن طريق الطلاء الدهني أخرى أو طلاء مع يغاندس محددة لمستقبلات افيروسيتيك اهتمام.
الطريقة المبينة في هذا البروتوكول له العديد من المزايا التدفق الخلوي على أساس الأساليب استخداماً في الميدان23،24. قبل التصوير مباشرة التفاعل خلية بلعمية-أبوبتوتيك، جنبا إلى جنب مع وضع العلامات واضحة كل المواد خلية apoptotic التام وغير مستوعبة، يمكن إجراء قياسات كمية افيروسيتوسيس. وعلاوة على ذلك، يحد استخدام fluorophores غير متحسسة للأس الهيدروجيني العوامل المؤثرة الأخرى مثل قمع fluorescence فيتك والتجارة والنقل على درجة الحموضة الليزوزومية أن يفند بعض الأساليب البديلة25. وأخيراً، حين لا يصف بالتفصيل، هذه الأساليب يمكن أن تستخدم باستخدام افيروسيتيس الإعراب عن المتسلسلات المسمى فلوريسسينتلي، أو مع إيمونوستينينج بعد انتهاء التثبيت، للسماح للتحديد الكمي ليشير إلى نشاط الجزيء ورصد العمليات الخلوية أثناء افيروسيتوسيس.
Protocol
Representative Results
Discussion
الأساليب المذكورة في هذا البروتوكول يمكن تصوير والتحديد الكمي لعملية افيروسيتيك الحيوية، واستخدام نهج ثابت-خلية وخلية يعيش. هذه النهج توفر العديد من المزايا على مدى تدفق العاملين عادة الأساليب المستندة إلى الخلوي23،24. ويوفر استخدام التلوين من الداخل إلى ا…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم تمويل هذه الدراسة بالمعاهد الكندية للصحة البحوث (استوفوا) العاملة بمنحه اجتماع الأطراف-123419، والعلوم الطبيعية والهندسة بحوث المجلس من كندا اكتشاف منحة 418194، ووزارة أونتاريو للبحوث والابتكار جائزة البحوث المبكرة للبوسنة والهرسك. الورشة ساهمت بعض الصور المعروضة، لتعظيم الاستفادة البروتوكولات وكتابة المخطوطة؛ أنه بتمويل من منحة مضخة فتيلة من جامعة ليفربول. وتمول قبرصي فانييه الدراسات العليا المنح الدراسية، واستوفوا MD/الدكتوراه سنهم. وكان وكالات التمويل أي دور في تصميم الدراسة أو جمع البيانات والتحليل، وقرار نشر أو إعداد المخطوطة.
Materials
| RPMI 1640 Media | Wisent | 3500-000-EL | |
| DMEM Media | Wisent | 319-005-CL | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Wisent | 080-150 | |
| PBS | Wisent | 311-010-CL | |
| 18 mm circular glass coverslips #1.5 thickness | Electron Microscopy Sciences | 72290-08 | Size and shape of coverslip is not critical, but 18 mm fit into the wells of a standard 12-well plate which simplifies cell culture |
| Staurosporine | Cayman Chemical | 81590 | Dissolve in DMSO at 1 mM (1,000x stock solution) |
| Annexin V-Alexa 488 | ThermoFisher | R37174 | |
| EZ-Link NHS-Biotin | ThermoFisher | 20217 | Store in a dessicator. Do not prepare a stock solution. |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| CellTrace FarRed | ThermoFisher | C34572 | |
| CellTrace Orange | ThermoFisher | C34851 | |
| Hoescht 33342 | ThermoFisher | 62249 | |
| FITC-Streptavadin | ThermoFisher | SA1001 | |
| Lympholyte-poly cell sepration medium | Cedarlane Labs | CL5071 | |
| Recombinant Human M-CSF | Peprotech | 200-04 | |
| Recombinant Human IL-4 | Peprotech | 300-25 | |
| J774.2 Macrophage Cell Line | Sigma-Aldrich | 85011428-1VL | |
| THP-1 Human Monocyte Cell Line | ATCC | TIB-202 | |
| Jurkat T Cell Line | ATCC | TIB-152 |
References
- Elmore, S. Apoptosis: A review of programmed cell death. Toxicologic Pathology. 35 (4), 495-516 (2007).
- Toda, S., Hanayama, R., Nagata, S. Two-step engulfment of apoptotic cells. Molecular and Cellular Biology. 32 (1), 118-125 (2012).
- Ravichandran, K. S. Find-me and eat-me signals in apoptotic cell clearance: Progress and conundrums. The Journal of Experimental Medicine. 207 (9), 1807-1817 (2010).
- Fadok, V. A., Voelker, D. R., Campbell, P. A., Cohen, J. J., Bratton, D. L., Henson, P. M. Exposure of phosphatidylserine on the surface of apoptotic lymphocytes triggers specific recognition and removal by macrophages. Journal of Immunology. 148 (7), 2207-2216 (1992).
- Bevers, E. M., Comfurius, P., van Rijn, J. L., Hemker, H. C., Zwaal, R. F. Generation of prothrombin-converting activity and the exposure of phosphatidylserine at the outer surface of platelets. European Journal of Biochemistry. 122 (2), 429-436 (1982).
- Callahan, M. K., Williamson, P., Schlegel, R. A. Surface expression of phosphatidylserine on macrophages is required for phagocytosis of apoptotic thymocytes. Cell Death and Differentiation. 7 (7), 645-653 (2000).
- Kojima, Y., et al. CD47-blocking antibodies restore phagocytosis and prevent atherosclerosis. Nature. 536, 86-90 (2016).
- Seitz, H. M., Camenisch, T. D., Lemke, G., Earp, H. S., Matsushima, G. K. Macrophages and dendritic cells use different Axl/Mertk/Tyro3 receptors in clearance of apoptotic cells. Journal of Immunology. 178, 5635-5642 (2007).
- Ichimura, T., Asseldonk, E. J. P. V., Humphreys, B. D., Gunaratnam, L., Duffield, J. S., Bonventre, J. V. Kidney injury molecule-1 is a phosphatidylserine receptor that confers a phagocytic phenotype on epithelial cells. The Journal of Clinical Investigation. 118 (5), 1657-1668 (2008).
- Flannagan, R. S., Canton, J., Furuya, W., Glogauer, M., Grinstein, S. The phosphatidylserine receptor TIM4 utilizes integrins as coreceptors to effect phagocytosis. Molecular Biology of the Cell. 25 (9), 1511-1522 (2014).
- Park, D., et al. BAI1 is an engulfment receptor for apoptotic cells upstream of the ELMO/Dock180/Rac module. Nature. 450 (7168), 430-434 (2007).
- Elliott, M. R., Koster, K. M., Murphy, P. S. Efferocytosis Signaling in the Regulation of Macrophage Inflammatory Responses. Journal of Immunology. 198 (4), 1387-1394 (2017).
- Yin, C., Kim, Y., Argintaru, D., Heit, B. Rab17 mediates differential antigen sorting following efferocytosis and phagocytosis. Cell Death & Disease. 7 (12), e2529 (2016).
- Kinchen, J. M., et al. A pathway for phagosome maturation during engulfment of apoptotic cells. Nature Cell Biology. 10 (5), 556-566 (2008).
- Yin, C., Argintaru, D., Heit, B. Rab17 mediates intermixing of phagocytosed apoptotic cells with recycling endosomes. Small GTPases. , 1-9 (2017).
- Silva, M. T. Secondary necrosis: The natural outcome of the complete apoptotic program. FEBS letters. 584 (22), 4491-4499 (2010).
- Thorp, E. B. Mechanisms of failed apoptotic cell clearance by phagocyte subsets in cardiovascular disease. Apoptosis. 15 (9), 1124-1136 (2010).
- Sarantis, H., Grinstein, S. Monitoring phospholipid dynamics during phagocytosis: application of genetically-encoded fluorescent probes. Methods in Cell Biology. 108, 429-444 (2012).
- Steinberg, B. E., Grinstein, S. Analysis of macrophage phagocytosis: Quantitative assays of phagosome formation and maturation using high-throughput fluorescence microscopy. Methods in Molecular Biology. 531, 45-56 (2009).
- Wang, J., Hossain, M., Thanabalasuriar, A., Gunzer, M., Meininger, C., Kubes, P. Visualizing the function and fate of neutrophils in sterile injury and repair. Science. 358 (6359), 111-116 (2017).
- Scott, C. C., et al. Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate hydrolysis directs actin remodeling during phagocytosis. The Journal of Cell Biology. 169 (1), 139-149 (2005).
- Greenlee-Wacker, M. C., Rigby, K. M., Kobayashi, S. D., Porter, A. R., DeLeo, F. R., Nauseef, W. M. Phagocytosis of Staphylococcus aureus by human neutrophils prevents macrophage efferocytosis and induces programmed necrosis. Journal of Immunology. 192 (10), 4709-4717 (2014).
- Wootton, D. G., et al. Recovery from pneumonia requires efferocytosis which is impaired in smokers and those with low body mass index and enhanced by statins. Thorax. 71 (11), 1052-1054 (2016).
- Miksa, M., Komura, H., Wu, R., Shah, K. G., Wang, P. A novel method to determine the engulfment of apoptotic cells by macrophages using pHrodo succinimidyl ester. Journal of Immunological Methods. 342 (1-2), 71-77 (2009).
- Kneen, M., Farinas, J., Li, Y., Verkman, A. S. Green fluorescent protein as a noninvasive intracellular pH indicator. Biophysical Journal. 74 (3), 1591-1599 (1998).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Johnson, D. E., Ostrowski, P., Jaumouillé, V., Grinstein, S. The position of lysosomes within the cell determines their luminal pH. The Journal of Cell Biology. 212 (6), 677-692 (2016).
- Evans, A. L., Blackburn, J. W. D., Yin, C., Heit, B. Quantitative efferocytosis assays. Methods in Molecular Biology. 1519, 25-41 (2017).
- Icha, J., Weber, M., Waters, J. C., Norden, C. Phototoxicity in live fluorescence microscopy, and how to avoid it. BioEssays. 39 (8), (2017).
- Flannagan, R. S., Harrison, R. E., Yip, C. M., Jaqaman, K., Grinstein, S. Dynamic macrophage "probing" is required for the efficient capture of phagocytic targets. The Journal of Cell Biology. 191 (6), 1205-1218 (2010).
- Joshi, G. N., Gilberti, R. M., Knecht, D. A. Single cell analysis of phagocytosis, phagosome maturation, phagolysosomal leakage, and cell death following exposure of macrophages to silica particles. Methods in Molecular Biology. 1519, 55-77 (2017).
- Karaji, N., Sattentau, Q. J. Efferocytosis of Pathogen-Infected Cells. Frontiers in Immunology. 8 (DEC), 1863 (1863).
- Harrison, R. E., Bucci, C., Vieira, O. V., Schroer, T. A., Grinstein, S. Phagosomes fuse with late endosomes and/or lysosomes by extension of membrane protrusions along microtubules: role of Rab7 and RILP. Molecular and Cellular Biology. 23 (18), 6494-6506 (2003).
- Reiners, J. J., Kleinman, M., Kessel, D., Mathieu, P. A., Caruso, J. A. Nonesterified cholesterol content of lysosomes modulates susceptibility to oxidant-induced permeabilization. Free Radical Biology & Medicine. 50 (2), 281-294 (2011).
- Boya, P., et al. Lysosomal membrane permeabilization induces cell death in a mitochondrion-dependent fashion. The Journal of Experimental Medicine. 197 (10), 1323-1334 (2003).
- Fairn, G. D., Grinstein, S. How nascent phagosomes mature to become phagolysosomes. Trends in Immunology. , 1-9 (2012).
- Canton, J., Khezri, R., Glogauer, M., Grinstein, S. Contrasting phagosome pH regulation and maturation in human M1 and M2 macrophages. Molecular Biology of the Cell. 25 (21), 3330-3341 (2014).
- Phanse, Y., et al. Analyzing cellular internalization of nanoparticles and bacteria by multi-spectral imaging flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (64), e3884 (2012).
- Sommer, C., Straehle, C., Kothe, U., Hamprecht, F. A. Ilastik: Interactive learning and segmentation toolkit. 2011 IEEE International Symposium on Biomedical Imaging: From Nano to Macro. , 230-233 (2011).
- Davies, S. P., Reynolds, G. M., Stamataki, Z. Clearance of apoptotic cells by tissue epithelia: A putative role for hepatocytes in liver efferocytosis. Frontiers in Immunology. 9, (2018).
- Ismail, O. Z., Zhang, X., Bonventre, J. V., Gunaratnam, L. G protein α12(Gα12) is a negative regulator of kidney injury molecule-1-mediated efferocytosis. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 310 (7), F607-F620 (2016).
- Vaught, D. B., Stanford, J. C., Cook, R. S. Efferocytosis creates a tumor microenvironment supportive of tumor survival and metastasis. Cancer Cell & Microenvironment. 2 (1), (2015).
- Heit, B., Yeung, T., Grinstein, S. Changes in mitochondrial surface charge mediate recruitment of signaling molecules during apoptosis. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 300 (1), C33-C41 (2011).
- Múnera, J. O., Wells, J. M. Generation of Gastrointestinal Organoids from Human Pluripotent Stem Cells. Methods in Molecular Biology. 1597, 167-177 (2017).
- Truman, L. A., et al. CX3CL1/fractalkine is released from apoptotic lymphocytes to stimulate macrophage chemotaxis. Blood. 112 (13), 5026-5036 (2008).
- Evans, A. L., et al. Antagonistic Coevolution of MER Tyrosine Kinase Expression and Function. Molecular Biology and Evolution. , (2017).
- Flannagan, R. S., Heit, B., Heinrichs, D. E. Intracellular replication of Staphylococcus aureus in mature phagolysosomes in macrophages precedes host cell death, and bacterial escape and dissemination. Cellular Microbiology. , (2015).
- Mubaid, F., Brown, C. M. Less is More: Longer Exposure Times with Low Light Intensity is Less Photo-Toxic. Microscopy Today. 25 (06), 26-35 (2017).
- Bogdanov, A. M., Kudryavtseva, E. I., Lukyanov, K. A. Anti-fading media for live cell GFP imaging. PloS One. 7 (12), e53004 (2012).
- Rossner, M., Yamada, K. M. What’s in a picture? The temptation of image manipulation. The Journal of Cell Biology. 166 (1), 11-15 (2004).
- Sage, D., et al. DeconvolutionLab2: An open-source software for deconvolution microscopy. Methods. 115, 28-41 (2017).
- Ma, G. Z. M., Stankovich, J., Kilpatrick, T. J., Binder, M. D., Field, J. Polymorphisms in the receptor tyrosine kinase MERTK gene are associated with multiple sclerosis susceptibility. PloS One. 6 (2), e16964 (2011).
- Thorp, E., Cui, D., Schrijvers, D. M., Kuriakose, G., Tabas, I. Mertk receptor mutation reduces efferocytosis efficiency and promotes apoptotic cell accumulation and plaque necrosis in atherosclerotic lesions of apoe-/- mice. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 28 (8), 1421-1428 (2008).
- Nguyen, K. -. Q. N., et al. Overexpression of MERTK Receptor Tyrosine Kinase in Epithelial Cancer Cells Drives Efferocytosis in a Gain-of-Function Capacity. The Journal of Biological Chemistry. 289 (37), 25737-25749 (2014).
- Morimoto, K., et al. Lovastatin enhances clearance of apoptotic cells (efferocytosis) with implications for chronic obstructive pulmonary disease. Journal of Immunology. 176 (12), 7657-7665 (2006).
