Количественная оценка Efferocytosis по микроскопии флуоресцирования одноклеточного

Summary

Efferocytosis, фагоцитарной удаление apoptotic клеток, необходимых для поддержания гомеостаза и облегчается рецепторов и сигнальных путей, которые позволяют для распознавания, поглощения и интернализация apoptotic клеток. Здесь мы представляем протокол микроскопии флуоресцирования для количественной оценки efferocytosis и активность efferocytic сигнальные пути.

Abstract

Изучение правил efferocytosis требует методы, которые способны точно подсчитать поглощение apoptotic клеток и датчик сигнализации и клеточных процессов, которые управляют efferocytosis. Эта количественная оценка может быть трудным для выполнения как apoptotic клетки часто efferocytosed по частям, таким образом создавая необходимость методы, которые можно точно описать между efferocytosed часть целевого объекта apoptotic против остаточного unengulfed сотовых фрагменты. Подход, изложенный в настоящем документе использует двойной маркировки подходы к точно количественно оценить динамику развития потенциала efferocytosis и efferocytic efferocytes, такие как макрофаги. Помечены цитозоль клетки apoptotic клетки отслеживания краситель, чтобы включить мониторинг всех apoptotic клеток, полученных материалов, в то время как поверхности biotinylation apoptotic клетки позволяет для дифференциации между внутренним и не учитываются apoptotic клеток дробей. Объем efferocytic efferocytes определяется принимая флуоресцентного изображения клеток живых или фиксированной и количественной количество связанного против внутренней цели, как дифференцированные по окрашиванию стрептавидина. Этот подход обеспечивает несколько преимуществ над методы, такие как проточной цитометрии, а именно точное разграничение не efferocytosed против efferocytosed apoptotic клеток фракций, возможность измерения динамики efferocytic, микроскопия живой клетки и способность выполнять исследования клеточной сигнализации в клетках, выражая дневно меченых трансгенов. Комбинированные, методы, изложенные в настоящем Протоколе служат основой для гибкого экспериментальный подход, который может использоваться для точного количественного определения efferocytic активности и допросить сотовой сигнальных путей, активные во время efferocytosis.

Introduction

Apoptosis или запрограммированная смерть клетки, является высоко регулируется физиологический процесс, который происходит в большинстве многоклеточных организмов и имеет решающее значение для их развития и гомеостаза¹. Помимо участия в нормальной клетки оборота и эмбрионального развития, апоптоз позволяет ликвидации зараженных или поврежденных клеток тканей и может срабатывать в ответ на инфекции, воспаления, рак, а также медицинских вмешательств Например, лучевой терапии или стероидов¹. Apoptotic клетки разоблачить «едят-me» сигналы на их поверхности клетки, которые признаны рецепторов на широкий спектр профессиональных и непрофессиональных фагоцитов, именуемые далее «efferocytes». Участие этих рецепторов вызывает поглощения и деградации apoptotic клетки, efferocyte через процесс, известный как efferocytosis^2,3. Фосфатидилсерин лучше всего характеризуется едят-мне сигнал вождения efferocytosis. Обычно ограничивается внутренним листовка плазматической мембраны, с apoptosis, активация скрамблаза липидов, которая нарушает этой асимметрии мембраны, тем самым подвергая Фосфатидилсерин на поверхности клеток⁴. Фосфатидилсерин находится на поверхности внеклеточного-apoptotic клеток, таких как зрелые макрофаги и активации тромбоцитов. Однако эти клетки являются не efferocytosed из-за присутствия «не ешь меня» сигналов, таких как CD47, на их клеток поверхности^5,6,7. Подвергаются Фосфатидилсерин признается массив efferocytic рецепторов, выраженную efferocytes. Связывание этих рецепторов к Фосфатидилсерин, либо непосредственно, либо через помощи опсонины, активирует сигнальных путей, способствующих сплошным apoptotic клеток в вакуоль мембраны прыгните называют efferosome^{8, 9 , 10 , 11 , 12}. efferosome предохранители последовательно с endosomes и лизосомы, которые доставляют молекулярный механизм, необходимый для подкислять efferosome и ухудшить apoptotic клетки грузов^13,14. После того, как деградация, apoptotic клеток производные материалы продаются в утилизации endosome — процесс, который ограничивает иммунных реакций к apoptotic клеток антигены, и которая может позволить для восстановления питательных веществ из клетки apoptotic^{13, 15}. Неудача в efferocytosis результаты в нарушение Распродажа apoptotic клеток; в конечном итоге эти необезвреженные клетки претерпевают вторичные некрозы. Отмершие клетки релиз про воспалительных цитозольной содержимое, патогенов и autoantigens в внеклеточной окружение, таким образом, движущей широкий спектр инфекционный, воспалительных и аутоиммунных заболеваний^16,17. Вместе, апоптоз и efferocytosis облегчить удаление мертвых и умирающих клеток и для поддержания гомеостаза ткани.

Изучение молекулярных механизмов лежащих в основе efferocytosis требует методы, которые обеспечивают четкую количественную оценку apoptotic клеток поглощения. Эта количественная оценка осложняется тем, что в отличие от других поглощения таких механизмов, как эндоцитоза и фагоцитоз^18,19, efferocytosis не может привести к сплошным нетронутыми целевой ячейки, в результате частичного поглощения apoptotic клетки efferocyte²⁰. Протокол, описываемые описывает в пробирке efferocytosis assay который обеспечивает точное разграничение интернализированных против-внутреннюю часть индивидуальных apoptotic клеток и могут быть объединены с целым рядом-клеток и микроскопия живой клетки подходы. Традиционные фагоцитоза анализов добавить антитела специфические фагоцитарной цели в конце эксперимента для того, чтобы называть не учитываются цели, где наш метод отличается маркировки apoptotic цель с ковалентно связан биотина^{21 , 22}. в то время как apoptotic клеток специфические антитела могут использоваться в этом assay, biotinylation подход позволяет для любого целевого белка подшипник быть помечены и избегает потенциальных проблем с перекрестной реактивности вторичные антитела, если выполняется иммуноокрашивания . В частности мы наметим подготовки apoptotic клеток Jurkat, которые были двойной окрашенных клеток отслеживания красителя и биотин. Ячейка, отслеживания краситель позволяет для apoptotic клеток, полученных материалов быть считано во время efferocytosis, тогда как поверхности biotinylation позволяет для дискриминации внутреннюю от-внутреннюю часть efferocytosed apoptotic клеток. Мы также описывают культуру и подготовка J774.2 и THP-1 клеточных линий для использования в качестве мышиных и человеческого efferocytes, моноцитарных м2 макрофагов в качестве примера главной ячейки efferocytosis, и Jurkat клетки для использования как efferocytic целей. Эти методы легко может применяться для других клеточных линий или первичной клетки, клетки-мишени любой форме клеточной смерти (например апоптоза, некроз и necroptosis) и имитирует микронного размера, имитирующие apoptotic клетки через липидного покрытия или покрытие с лигандами, специфичные для efferocytic рецептор интерес.

Метод, изложенные в настоящем Протоколе имеет ряд преимуществ над методами цитометрии на основе потока, широко используется в области^23,24. Непосредственно визуализации фагоцитарной apoptotic клеток взаимодействия, в сочетании с четкой маркировки как общая и не учитываются apoptotic клеток материала, можно сделать количественные показатели efferocytosis. Кроме того использование рН нечувствительным флуорофоров ограничивает отягощающих факторов, таких, как подавление FITC и GFP флуоресценции в лизосомальных рН, который смешивает некоторые альтернативные методы²⁵. И наконец, хотя не подробно, эти методы могут быть использованы с помощью efferocytes, выражая дневно меченых трансгенов, или с иммуноокрашивания после фиксации, для количественной оценки сигнальные молекулы деятельность и мониторинг клеточные процессы во время efferocytosis.

Protocol

Сбор крови от здоровых добровольцев был одобрен Советом здравоохранения этики научных исследований науки в университете Западного Онтарио. Венепункции была выполнена в соответствии с руководящими принципами изложения политики Tri-Совет по исследований человеческого. 1. …

Representative Results

Культура клеток Jurkat с 1 мкм staurosporine результаты в апоптоз в одночасье > 95% клеток, которые могут быть подтверждены с Annexin V окрашивание (рис. 1). Другие типы клеток может использоваться для этих экспериментов, хотя концентрация staurosporine и продолжительность ле?…

Discussion

Методы, изложенные в настоящем Протоколе позволяют изображений и количественной оценки процесса динамического efferocytic, используя подходы в-клеток и клеток. Эти подходы предлагают несколько преимуществ над обычно занятых потока методы на основе цитометрии^23,<sup class="xref"…

Materials

RPMI 1640 Media	Wisent	3500-000-EL
DMEM Media	Wisent	319-005-CL
Fetal Bovine Serum (FBS)	Wisent	080-150
PBS	Wisent	311-010-CL
18 mm circular glass coverslips #1.5 thickness	Electron Microscopy Sciences	72290-08	Size and shape of coverslip is not critical, but 18 mm fit into the wells of a standard 12-well plate which simplifies cell culture
Staurosporine	Cayman Chemical	81590	Dissolve in DMSO at 1 mM (1,000x stock solution)
Annexin V-Alexa 488	ThermoFisher	R37174
EZ-Link NHS-Biotin	ThermoFisher	20217	Store in a dessicator. Do not prepare a stock solution.
DMSO	Sigma-Aldrich	D2650
CellTrace FarRed	ThermoFisher	C34572
CellTrace Orange	ThermoFisher	C34851
Hoescht 33342	ThermoFisher	62249
FITC-Streptavadin	ThermoFisher	SA1001
Lympholyte-poly cell sepration medium	Cedarlane Labs	CL5071
Recombinant Human M-CSF	Peprotech	200-04
Recombinant Human IL-4	Peprotech	300-25
J774.2 Macrophage Cell Line	Sigma-Aldrich	85011428-1VL
THP-1 Human Monocyte Cell Line	ATCC	TIB-202
Jurkat T Cell Line	ATCC	TIB-152