כימות של Efferocytosis על-ידי קרינה פלואורסצנטית תא בודד מיקרוסקופ

Summary

Efferocytosis, הסרת phagocytic בתאים אפופטוטיים להיפגע, הוא נדרש כדי לשמור על הומאוסטזיס, בהנחייתם של רצפטורים, איתות המסלולים המאפשרים זיהוי, היבלעות של הפנמה של מוות תאים. במסמך זה, אנו מציגים מיקרוסקופ פלורסצנטיות פרוטוקול עבור כימות של efferocytosis וכן את פעילותם של efferocytic איתות המסלולים.

Abstract

לומד ברגולציה של efferocytosis דורש שיטות שבהן ניתן לכמת במדויק את ספיגת בתאים אפופטוטיים להיפגע וכדי לחקור את התהליכים איתות וסלולריות השולטים efferocytosis. כימות זה יכול להיות קשה לביצוע כמו מוות תאים הם לעתים קרובות efferocytosed תקנה, ובכך המחייב שיטות אשר יכול ניסחו באופן מדויק בין החלק efferocytosed של מטרה אפופטוטיים להיפגע לעומת שיורית סלולרי unengulfed שברי. הגישה המתוארים במסמך זה מנצל כפול-תיוג גישות לכמת במדויק את הדינמיקה של קיבולת efferocytosis ו- efferocytic של efferocytes כגון מקרופאגים. ציטוזול התא מוות מסומן עם צבע התא-מעקב כדי לאפשר פיקוח על כל מוות נגזר תא החומרים, בעוד biotinylation פני השטח של התא אפופטוטיים להיפגע מאפשר בידול בין למביטה והפנמתי הלא מוות תא שברים. יכולת efferocytic של efferocytes נקבע על-ידי לקיחת תמונות פלורסנט של תאים חיים או קבוע לכימות כמות מאוגד נגד מטרות למביטה, כפי מובחנת על ידי צביעת streptavidin. גישה זו מציעה מספר יתרונות על פני שיטות כגון cytometry זרימה, כלומר את התיחום מדויק של הלא-efferocytosed לעומת efferocytosed מוות תא שברים, היכולת למדוד דינמיקה efferocytic על ידי מיקרוסקופ לחיות תאים, ו היכולת לבצע מחקרים של איתות בתאים המבטאים שכותרתו fluorescently transgenes. משולב, השיטות המתוארות ב פרוטוקול זה תשמש כבסיס לגישה ניסויית גמיש יכול לשמש כדי לכמת במדויק את פעילות efferocytic ולחקור הסלולר איתות המסלולים פעיל במהלך efferocytosis.

Introduction

אפופטוזיס, או מוות תאים מתוכנת, היא תהליך פיזיולוגי מאוד מווסתות מתרחשת אצל רוב אורגניזמים רב תאיים, הוא קריטי עבור שלהם ופיתוח הומאוסטזיס¹. בנוסף להיות מעורב תחלופת תאים נורמליים ופיתוח עובריים, אפופטוזיס מאפשר חיסול של תאים נגועים או פגומים של רקמות, יכולה להיות מופעלת בתגובה זיהום, דלקת, סרטן, וגם על ידי התערבויות רפואיות כגון הקרנות או סטרואידים¹. מוות תאים לחשוף “לאכול-לי” אותות על פני השטח של התא, אשר מוכרים על ידי רצפטורים על מגוון של phagocytes מקצועי, בלתי מקצועיים, המכונות במקובץ “efferocytes”. האירוסין של רצפטורים אלו המניע את ספיגת והשפלה של התא אפופטוטיים להיפגע על ידי efferocyte באמצעות תהליך המכונה efferocytosis^2,3. Phosphatidylserine הוא הטוב ביותר מאופיין לאכול-לי אות efferocytosis נהיגה. זה בדרך כלל מוגבל העלעל הפנימי של קרום פלזמה, עם אפופטוזיס הפעלה של scramblase שומנים בדם אשר משבש סימטריה קרום זה, ובכך חושף בפני phosphatidylserine על פני השטח התא⁴. Phosphatidylserine נמצא על פני השטח חוץ-תאי של כמה תאים שאינם אפופטוטיים להיפגע, כגון מקרופאגים בוגרת ומופעל טסיות. עם זאת, תאים אלה אינם efferocytosed בשל נוכחותם של “אל תאכל אותי” אותות, כגון CD47,^6,שלהם משטח^5,תא⁷. Phosphatidylserine חשוף מזוהה על ידי מערך של קולטני efferocytic לידי ביטוי efferocytes. איגוד של רצפטורים אלו כדי phosphatidylserine, ישירות או באמצעות הסיוע של opsonins, הפעלת איתות המסלולים המקדמים את היבלעות של התא אפופטוטיים להיפגע לתוך חלולית ממברנה מכורך כינה את efferosome^{8, 9 , 10 , 11 , 12}. efferosome ולספות ברצף עם endosomes ו lysosomes, אשר מספקים את המנגנון המולקולרי הדרושים כדי acidify את efferosome וכדי לבזות את מוות תא המטען^13,14. ברגע מושפל, החומרים הנגזרות תא אפופטוטיים להיפגע הם הנסחר אנדוזום מיחזור – תהליך אשר מגביל את תגובות מערכת החיסון כדי מוות נגזר תא אנטיגנים, אשר עשוי לאפשר התאוששות של חומרים מזינים מוות תא^{13, 15}. כישלון efferocytosis תוצאות סיקול לקוי של מוות תאים; תאים אלה שלא סולק בסופו של דבר עוברים נמק משנית. תאים עם נמק לשחרר תוכן cytosolic פרו דלקתיים, פתוגנים, autoantigens לתוך חצרו חוץ-תאית, ובכך גרמה מגוון של מחלות זיהומיות, דלקתית אוטואימונית^16,17. יחד, אפופטוזיס ועל efferocytosis להקל על הסרת תאים מתים וכל מת וגם מאפשרים שמירה על הומאוסטזיס רקמות.

לחקור את המנגנונים המולקולריים שבבסיס efferocytosis דורש שיטות המספקים כימות ברורה של ספיגת תא אפופטוטיים להיפגע. כימות הזה, זה מורכב על ידי העובדה כי בניגוד אחרים ספיגת מנגנונים כגון אנדוציטוזה phagocytosis^18,19, efferocytosis לא עלולה היבלעות של תא היעד ללא פגע, והתוצאה היא תפיסה טיפין טיפין התא אפופטוטיים להיפגע על-ידי efferocyte²⁰. הפרוטוקול המתואר במסמך זה מתאר של במבחנה efferocytosis assay המספק תיחום מדויק של למביטה לעומת הלא-הפנימו חלקים של תאים בודדים אפופטוטיים להיפגע, יכול להיות משולב עם מגוון תאים קבוע, גישות לחיות תאים במיקרוסקופ. מבחני phagocytosis מסורתי להוסיף נוגדנים ספציפיים אל היעד phagocytic בסוף הניסוי כדי לתייג לא הפנימו את המטרות, בעוד השיטה שלנו שונה בכך labelling המטרה אפופטוטיים להיפגע עם ביוטין מקושר covalently^{21 , 22}. בזמן מוות תא נוגדנים ספציפיים שיכולים לשמש זה וזמינותו, הגישה biotinylation מאפשר עבור כל מטרה חלבון מניבי להיות מתויגת, מונע בעיות אפשריות עם נוגדנים משניים אשיג אם immunostaining מתבצע . באופן ספציפי, אנחנו חלוקה לרמות את הכנת אפופטוטיים להיפגע Jurkat תאים שעברו שהוכתמו כפול עם צבע מעקב תא והן ביוטין. מעקב אחר לצבוע את התא מאפשר אפופטוטיים להיפגע חומרים נגזר התא להיות במעקב במהלך efferocytosis, ואילו biotinylation משטח מאפשר האפליה של הפנימו מחלקים שאינם הפנימו efferocytosed מוות תאים. אנו מתארים גם את התרבות והכנה של שורות תאים J774.2 ו- THP-1 עבור שימוש כמו efferocytes מאתר ואנושי, נגזר מונוציט מקרופאגים M2 כדוגמה efferocytosis התא הראשי ותאים Jurkat לשימוש כמטרות efferocytic. שיטות אלה ניתן להחיל בקלות שורות תאים או ראשי תאים, התאים היעד שעברו כל צורה של מוות תאי (אפופטוזיסלמשל , נמק, necroptosis), וכדי מחקה בגודל מיקרון שידמה מוות תאים דרך השומנים ציפויים אחרים או ציפוי עם ליגנדים ספיציפית הקולטן efferocytic עניין.

השיטה המתוארות ב פרוטוקול זה יש כמה יתרונות על פני שיטות cytometry מבוסס זרימה נפוץ^23,שדה²⁴. על ידי הדמיה ישירות את האינטראקציה תא פגוציט-מוות, בשילוב עם תיוג ברור של שני חומר תא הכולל והפנמתי הלא מוות, מדדים כמותיים של efferocytosis יכול להתבצע. יתר על כן, מגביל השימוש fluorophores pH-רגישות גורמים מבלבלים כגון הדיכוי של זריחה FITC ו- GFP ב- pH lysosomal שמבלבלת כמה שיטות אלטרנטיביות²⁵. לבסוף, בעוד לא תיאר בפירוט, שיטות אלה יכול להיות מועסק באמצעות efferocytes לבטא שכותרתו fluorescently transgenes, או עם קיבוע שאחרי immunostaining, כדי לאפשר על כימות של פעילות מולקולת איתות וניטור של תהליכים תאיים במהלך efferocytosis.

Protocol

אוסף של דם מתנדבים בריאים אושרה על ידי הלוח אתיקה של אוניברסיטת מערב אונטריו מחקר מדעי בריאות. Venipuncture בוצעה בהתאם לקווים המנחים של הצהרת מדיניות Tri-המועצה על מחקר אנושי. 1. תרבות והכנה של הקו הסלולרי מונוציט THP-1 תרבות ומונוציטים THP-1 כתרבות התלוי ב- T25 מבחנות ב- C ° 37 + 5% CO2…

Representative Results

לילה של תאים Jurkat עם תוצאות staurosporine 1 מיקרומטר אפופטוזיס של תרבות > 95% של תאים, אשר יכולים להיות מאושרות עם Annexin V מכתים (איור 1). סוגי תאים אחרים יכול לשמש לניסויים אלה, למרות הריכוז של staurosporine, משך הטיפול staurosporine יצטרכו להיות ממוטבים עבור כל קו תא. זיהוי אמין, כי?…

Discussion

השיטות המתוארות ב פרוטוקול זה לאפשר הדמיה כימות של תהליך דינמי efferocytic, שימוש בגישות תא קבוע והן תאים חיים. גישות אלה מציעים כמה יתרונות על פני^23,שיטות מבוססות cytometry זרימה הנפוצות²⁴. השימוש מבפנים ומבחוץ מכתים עם דגימות קבוע מספק של כימות מדויק ועמיד יותר של קצ?…

Materials

RPMI 1640 Media	Wisent	3500-000-EL
DMEM Media	Wisent	319-005-CL
Fetal Bovine Serum (FBS)	Wisent	080-150
PBS	Wisent	311-010-CL
18 mm circular glass coverslips #1.5 thickness	Electron Microscopy Sciences	72290-08	Size and shape of coverslip is not critical, but 18 mm fit into the wells of a standard 12-well plate which simplifies cell culture
Staurosporine	Cayman Chemical	81590	Dissolve in DMSO at 1 mM (1,000x stock solution)
Annexin V-Alexa 488	ThermoFisher	R37174
EZ-Link NHS-Biotin	ThermoFisher	20217	Store in a dessicator. Do not prepare a stock solution.
DMSO	Sigma-Aldrich	D2650
CellTrace FarRed	ThermoFisher	C34572
CellTrace Orange	ThermoFisher	C34851
Hoescht 33342	ThermoFisher	62249
FITC-Streptavadin	ThermoFisher	SA1001
Lympholyte-poly cell sepration medium	Cedarlane Labs	CL5071
Recombinant Human M-CSF	Peprotech	200-04
Recombinant Human IL-4	Peprotech	300-25
J774.2 Macrophage Cell Line	Sigma-Aldrich	85011428-1VL
THP-1 Human Monocyte Cell Line	ATCC	TIB-202
Jurkat T Cell Line	ATCC	TIB-152