Målet med denne protokol er at lette undersøgelsen af NMDA-receptorer (NMDAR) på en større skala og giver mulighed for undersøgelse af modulerende virkningerne af små molekyler og deres terapeutiske anvendelsesmuligheder.
N-methyl-D-aspartat (NMDA) receptorer (NMDAR) er klassificeret som ionotropic glutamat receptorer og spiller en kritisk rolle i indlæring og hukommelse. NMDAR fejl, udtrykt som enten over – eller under – activity forårsaget af mutationer, ændrede udtrykket, menneskehandel eller lokalisering, kan bidrage til mange sygdomme, især i det centrale nervesystem. Derfor er forstå den receptor biologi samt lette opdagelsen af forbindelser og små molekyler afgørende i igangværende bestræbelser på at bekæmpe neurologiske sygdomme. Nuværende metoder til at studere receptoren har begrænsninger herunder lav overførselshastighed, høje omkostninger og manglende evne til at studere dets funktionelle evner på grund af den nødvendige tilstedeværelse af kanal blokkere at forhindre NMDAR-medieret excitotoxicity. Derudover de eksisterende assay systemer er følsomme over for stimulation af glutamat kun og manglende følsomhed over for stimulation af glycin, de andre Co ligand på NMDAR. Her præsenterer vi den første plade-baseret analyse med høj overførselshastighed magt til at studere en NMDA-receptor med følsomhed over for både Co ligander, glutamat og D-Serin/glycin. Denne tilgang giver mulighed for undersøgelse af forskellige NMDAR subunit kompositioner og tillader funktionelle studier af receptor i glycin – og/eller glutamat-følsomme tilstande. Metoden kræver desuden ikke tilstedeværelsen af hæmmere under målingerne. Effekten af positive og negative allosteriske modulatorer kan registreres med denne analyse og den kendte Farmakologi af NMDAR er blevet replikeret i vores system. Denne teknik overvinder begrænsningerne af eksisterende metoder og er omkostningseffektivt. Vi mener, at denne nye teknik vil fremskynde opdagelsen af terapier for NMDAR-medieret patologier.
Med de nuværende fremskridt i medicin, er levealder steget betydeligt; men så har forekomsten af aldersbetingede sygdomme. Sygdomme i centralnervesystemet (CNS) som skizofreni, amyotrofisk lateral sklerose (ALS), Alzheimers sygdom og Parkinsons sygdom, blandt andre, er ingen undtagelse og har blevet fremskrevet til at stige i det næste årti1, 2 , 3. fejlfunktion af ionotropic glutamat receptorer kendt som N-methyl-D-aspartat receptorer (NMDAR) har været forbundet med Alzheimers sygdom, skizofreni, traumatisk hjerneskade, slagtilfælde, diabetes og glaukom blandt andre, som garanterer de nødt til at undersøge deres biologi for udviklingen af effektive, Sygdomsmodificerende behandlinger4,5,6,7.
NMDARs er sammensat af fire monomerer eller underenheder4,8,9. Den strukturelle sammensætning af NMDAR viser udviklingsmæssige og regional variation inden for hjernen7,10. NMDARs er involveret i synaptisk plasticitet, kognition og generation af rytmer for vejrtrækning og bevægelse11,12,13. Som en spænding-gated kanal, det er stort set ikke-ledende på hvile membran potentiale (-70 mV) og blokeres af magnesium til at forhindre yderligere gennemtrængning af ioner. Kanalen er aktiveret ved at binde to ligander, glutamat og glycin/D-Serin, og en samtidig depolarisering på synaptic membranen medieret af AMPA-receptorer, et andet underklasse af ionotropic glutamat receptorer. Depolarisering fjerner magnesium blokering af NMDAR, at tilstrømningen af kationer, især calcium14,15,16. Selvom aktivering af NMDAR er afgørende for celle overlevelse, kan overdreven aktivering føre til celle død17,18,19 gennem excitotoxicity. Dette, ud over den komplekse karakter af receptoren, gør det udfordrende for at udføre undersøgelser nødvendige for at udvikle effektive behandlinger.
Forskellige metoder er blevet udviklet for at studere NMDAR. Hver enkelt har dog ledsager forbehold. For eksempel, er en meget udbredt teknik et fluorescens-baseret analyse, der måler NMDAR-medieret ændringer i intracellulære calcium i en stabil cellelinie under kontrol af en tetracyklin-inducerbar promotor (Tet-On)20. Men i dette system, supramaximal koncentrationer af ligander, der er nødvendige, og kravet om at NMDAR hæmmere er til stede under målingen gør det næsten umuligt at opdage aktivitet af konkurrencedygtige antagonist. I andre tilsvarende systemer forårsager udtryk for den funktionelle receptor toksicitet, der kræver kanal blokkere såsom ketamin21,22 at bevare cellekulturer. Disse kanal blokkere sidde kernen i receptoren og er svære at vaske ud, især i en plade-baseret format, så de forstyrrer funktionelle studier af receptor. I elektrofysiologiske målinger såsom patch fastspænding, der er begrænset overførselshastighed og store undersøgelser er meget dyre23. Trods er de ovennævnte systemer ufølsom over for glycin stimulation; dermed, at studere glycin-afhængig aktivitet af NMDAR bliver en udfordring.
Her, beskrive vi en ny tilgang til at studere NMDAR, der overvinder de omtalte begrænsninger. Vores teknik udnytter baculovirus ekspressionssystem udtrykke receptor på funktionelle niveauer med et optimalt forhold for underenheder i så lidt som 16 timer. Desuden brug af baculovirus giver mulighed for en simpel og kombinatorisk tilgang, som giver en bred karakterisering af de særskilte rekombinante NMDAR undertyper. I modsætning til andre assays kræver denne protokol ikke kanal blokkere på grund af brugen af svage antagonister. Metodens stærkeste fordel er, at efter udvaskning af de svage antagonist, receptoren er følsomme over for graduering af de enkelte glycin – og glutamat-bindingssteder ud over dobbelt graduering af både glycin/D-Serin og glutamat ligand-bindende websteder. Analysen indeholder kendte Farmakologi af NMDAR receptoren og virkningerne af dens kendte positive og negative modulatorer. Endelig, generation af denne i vitro cellulære assay overvinder den cellulære toksicitet forårsaget af overdreven calcium tilstrømning og giver mulighed for funktionelle studier af receptor i en høj overførselshastighed mode, som kan fremskynde opdagelser af NMDAR modulatorer i sygdomstilstande.
Dette assay succes afhænger i høj grad sundhed HEK celler anvendes. Celler gennemgår eksponentiel vækst og med lav passage nummer bør anvendes. Denne analyse indebærer mange overførsler og tilføjelser af løsninger, så ved hjælp af forsigtighed vil sikre højere præcision i sine resultater. Koncentrationer af forbindelser og alle andre reagenser skal krydscheckes også at minimere fejl. Når du udskifter celle medier med analysebuffer til calcium flux assay, skal pladen vippes forsigtigt så at cellerne ikke f…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne takke studentereksamen lærde Program posthus og Novartis institutter for biomedicinsk forskning som helhed til finansiering af denne undersøgelse.
HEK-293 | ATCC | CRL-1573 | |
Human NMDA (NR1/NR2A) Receptor Cell Line | ChanTest Corporation | CT6120 | |
pFastBac Dual Expression Vector | ThermoFisher Scientific | 10712-024 | |
Corning 384-well Clear Flat Bottom Microplate | Corning Life Sciences | 3844 | |
FLIPR Calcium 6-QF Assay Kit | Molecular Devices | R8192 | |
Glycine | Sigma-Aldrich | G7126 | |
Glutamate | Sigma-Aldrich | 49621 | |
D-serine | Sigma-Aldrich | S4250 | |
L701,324 | Tocris | 907 | |
HEPES Buffer | Boston Bio Product | BB-103 | |
Magnesium Chloride Solution | Sigma-Aldrich | 63069 | |
Calcium Chloride | VWR | E506 | |
HBSS | ThermoFisher Scientific | 14025-092 | |
Probenecid | ThermoFisher Scientific | P36400 | |
DMEM/F-12, GlutaMAX media | ThermoFisher Scientific | 10565018 | |
MDL105,519 | NIBR | Synthesized in house | |
NVP-AAM077 | NIBR | Synthesized in house | |
CGP070667 | NIBR | Synthesized in house |